基于梅花鹿感染布魯氏菌的檢測(cè)技術(shù)

1基于梅花鹿感染布魯氏菌的檢測(cè)技術(shù)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了診斷梅花鹿感染布病所用的常規(guī)分離鑒定、qPCR檢測(cè)方法及血樣ELISA檢測(cè)技術(shù)的LY/T2017養(yǎng)鹿場(chǎng)良好管理規(guī)范NY5027無公害食品畜禽飲用水水質(zhì)4縮略語(yǔ)Ct值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreactioqPCR：實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-timepolymeras25.3精液采樣器。5.4高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，可控溫至4℃,離心速度可達(dá)12000g以上。5.6渦旋震蕩儀。5.7無菌注射器或EP管。5.10恒溫水浴鍋：0℃~1005.12高壓滅菌鍋。5.14洗板機(jī)。5.15恒溫培養(yǎng)箱。5.16酶標(biāo)儀。3導(dǎo)致仔鹿很難成活。在分娩的流產(chǎn)物和奶液中含有大a）采血：從病鹿頸靜脈采集約5mL血液，或從母鹿采集5mb）收集：將采集的血液放入無菌試管中。c)離心：將試管放入離心機(jī)，以2000轉(zhuǎn)/分對(duì)于采集的鹿的組織樣品及疑似感染病料按以下方法處理并接種于培養(yǎng)基,樣品采集按照GB/Tb）病料采集：增加病料采集的種類，這可能包括血液、尿液、糞便、組織切片等，每種病料都應(yīng)d)標(biāo)記和記錄：詳細(xì)記錄樣本的采集時(shí)間、地點(diǎn)、動(dòng)物標(biāo)識(shí)和采集者信息，并在樣本容器上進(jìn)行e)運(yùn)輸：樣本應(yīng)在適宜的條件下運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，以保持b)細(xì)菌的分離：取5g組織剪成小塊,加入10mL無菌PBS緩沖液進(jìn)行研磨后,取200μL接種于選擇光澤，半透明。從上面看，菌落微隆起，灰d）染色觀察：用移液器吸取結(jié)晶紫稀釋染液（制），e)觀察和記錄：在培養(yǎng)過程中，定期觀察樣本的生長(zhǎng)情4f)后續(xù)分析：根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果，進(jìn)行進(jìn)一步的分析和檢測(cè)，如PCR、ELISA、9.1主要試劑滅菌雙蒸水或去離子水，細(xì)菌基因組提取試劑盒，qPCR擴(kuò)增預(yù)混液，引物（上下游引物濃度分別為12.5μmol/L，探針濃度為1μmol），可以采用引物BrqPCR-F/BrqPCR-R、探針BrqPCRprBrqPCR-FBrqPCR-RATCGTTTCCGGGTAAAGCGTCGC9.2操作步驟1-2μLBrqPCR-F1μLBrqPCR-R1μL2.5μL3μL3μL5μL9.2.2每次進(jìn)行qPCR反應(yīng)時(shí)應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照是以擴(kuò)增），程中，同時(shí)對(duì)HIbuffer緩沖液進(jìn)行提取后的DNA。9.2.4質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)如果陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增曲線有明顯對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，且Ct值≤25，陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線無Ct值顯示，說明質(zhì)59.2.5結(jié)果判定），加入工作濃度的HRP標(biāo)記兔抗鹿IgG抗體，100μL封口膜，甩掉孔內(nèi)液體，每孔加300μL洗滌液，洗滌3次，每次1min，最后一次拍干。加入TMB底物溶液，100μL/孔，37℃避光孵育10min。6P（標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清）/N（標(biāo)準(zhǔn)陰性血清）≥4或PCX-NCX>0.15，NCX≤0.3說明質(zhì)控合格。其中NCX（標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清的平均）=[NC1A(450)+NC2A(450)]/2；PCX（標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的平均）=[PC1A(450)+PC2A(450)計(jì)算S/P：S/P=（樣本OD450平均值-NCX）/（PCX-NCX）若S/P＞0.29，判為布魯氏菌抗體陽(yáng)性，若S/7A.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基瓊脂15g～20g；蛋白胨10g；氯化鈉加水1000mL上述成分混合，加熱使瓊脂溶化，然后調(diào)pH至7.8，再將培養(yǎng)基分裝三角瓶中，然后置20磅(1磅≈0.00689MPa)高壓滅菌A.2血清葡萄糖培養(yǎng)基A.3選擇培養(yǎng)基在1000mL血清葡萄糖培養(yǎng)基中加入下列成分，即為選擇若培養(yǎng)羊種布魯氏菌，需1000ml血清葡萄糖培養(yǎng)基中加入8A液和B液充分混合后即為儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液應(yīng)在密封瓶中4℃避光保存，可使用3個(gè)月。9引物BrZL-F/MSZL-R（25pmol/μL）、膠回收試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒、pMD-19T質(zhì)粒、感受態(tài)上游引物BrZL-F：5'-TGGCTCGGTTGC下游引物BrZL-R：5'-CGCGCTTGCCTT用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，與pMD-19T克隆載體連接，布于含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12~16h。篩選出C.5.2根據(jù)擴(kuò)增情況從中選取5~6個(gè)點(diǎn)制作適合標(biāo)準(zhǔn)曲線要求的標(biāo)準(zhǔn)超聲波細(xì)胞破碎儀，恒溫?fù)u床，制冰機(jī)，紫外可見分光光度引物（25pmol/μL）,BamHI限制性內(nèi)切酶，XhoI限制性內(nèi)切基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒，LB培養(yǎng)基，一次性針頭濾器（孔徑D.3序列合成及表達(dá)載體的構(gòu)建D.4.1取A.3中的菌液，以1:100的00r/min震蕩培養(yǎng)至菌液OD600值0.6～0.8，加入終濃度為1.0mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)培養(yǎng)5h。/min離心10min，棄上清。D.4.4用15mLpH7.4PBS重懸沉淀，充分吹散混勻，將離心管置于碎冰中，再放到超聲波細(xì)胞破碎儀中，以超聲5s，間隔1s的程序，超聲破碎30D.4.7純化后的蛋白溶液，用0.45μm一次性針頭濾器過濾除菌。D.4.8用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定蛋白的濃度，蛋白濃度達(dá)到0.D.4.9用高效液相色譜法進(jìn)一步純化并分析蛋白純度，純度達(dá)到90%以上符合要求。Na2CO3NaHCO3200mL將Na2CO3和NaHCO3加入去離子水中，完全溶解后，用0.45μm一次性針頭濾器過濾除菌，室溫保