T-QMHIPA 001-2024 人肝內(nèi)膽管癌類器官培養(yǎng)與鑒定

CCSA40《人肝內(nèi)膽管癌類器官培養(yǎng)與鑒定》CultureandIdentificationofPatient-DerivedOrganoidsforIntrahepaticCholangiocarcinomaI II 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4縮略語 5倫理要求 6場地及環(huán)境要求 7樣本采集 8肝內(nèi)膽管癌類器官的構(gòu)建、傳代、凍存、復(fù)蘇及處置 9關(guān)鍵參數(shù)及檢測(cè)方法 10生物安全 參考文獻(xiàn) 本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起本標(biāo)準(zhǔn)在全國團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)信息平臺(tái)審核并發(fā)布。本文件由青島市醫(yī)養(yǎng)健康產(chǎn)業(yè)促進(jìn)會(huì)提出并組織實(shí)施。本文件由青島市醫(yī)養(yǎng)健康產(chǎn)業(yè)促進(jìn)會(huì)牽頭歸口。本文件起草單位：青島海爾生物科技有限公司、青島市醫(yī)養(yǎng)健康產(chǎn)業(yè)促進(jìn)會(huì)、青島市中心醫(yī)院、青島市市立醫(yī)院、山東大學(xué)齊魯醫(yī)院（青島）、青島大學(xué)附屬醫(yī)院、青島大學(xué)、西安交通大學(xué)、武漢大學(xué)中南醫(yī)院、哈爾濱醫(yī)科大學(xué)、五邑大學(xué)、山東大學(xué)齊魯醫(yī)院、襄陽市第一人民醫(yī)院、山東省第一醫(yī)科大學(xué)、安徽醫(yī)科大學(xué)、健康醫(yī)療大數(shù)據(jù)山東省工程研究中心、萬鏈數(shù)科（青島）投資控股有限公司、煙臺(tái)魯東醫(yī)院；青島華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司、青島華賽伯曼醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物有限公司、青島中德華大基因生物科技有限公司、青島瑞源細(xì)胞科技開發(fā)有限公司、青島市計(jì)量技術(shù)研究院、青島瑞思德生物科技有限公司、青島慧全鈺智能科技有限公司、青島賽爾斯干細(xì)胞庫有限公司；廣東省奧干諾伊德生物科技有限公司、浙江弘瑞醫(yī)療科技有限公司、中山阿拉丁生物科技有限公司、寧波海益生物科技有限公司。本文件起草人：曹啟龍(青島市醫(yī)養(yǎng)健康產(chǎn)業(yè)促進(jìn)會(huì)執(zhí)行會(huì)長)、王琳、李云霄、王飛、姚雪瑞、初相伍、李沙沙、金南衡、薛楊、賈慶佳、羅國安、王義明，蔡金貞、曹俊寧、蘆琳琳、裴斌、董佑紅、張冬冬、楊鐵林、郭燕、魏永長、郭源、關(guān)鴿、田藍(lán)天、李紅梅、曹彩霞、王棟、李菁、曹俊、李英花、王穎翠、史光軍、張思浩、紀(jì)順師、苑學(xué)禮、鄭鴻平、李棟、王芝輝、王志衛(wèi)、高青、劉成龍、于亞平、王叢先、陳夢(mèng)夢(mèng)、邢海峰、金繼榮、鄧婧、孫建、汪嵐、王立平。本標(biāo)準(zhǔn)屬首次發(fā)布。1人肝內(nèi)膽管癌類器官培養(yǎng)與鑒定本文件規(guī)定了人肝內(nèi)膽管癌類器官的倫理要求、技術(shù)要求和檢測(cè)方法。適用于患者來源的人肝內(nèi)膽管癌類器官的培養(yǎng)和鑒定。本文件適用于基于人肝內(nèi)膽管癌類器官開展個(gè)體精準(zhǔn)醫(yī)療和藥物開發(fā)等研究和轉(zhuǎn)化。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，標(biāo)注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不標(biāo)注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。WS213丙型肝炎診斷WS293艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標(biāo)準(zhǔn)WS299乙型病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國藥典（2020年版）全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程GB/T38736-2020人類生物樣本保藏倫理要求3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1類器官organoids由干細(xì)胞或前體細(xì)胞體外培養(yǎng)形成，有組織器官特異性的多種細(xì)胞組成，具有特定器官關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和功能特性的三維（3D）細(xì)胞培養(yǎng)物。3.2患者來源腫瘤類器官patient-derivedorganoids(PDOs)由患者的腫瘤組織或其他含腫瘤細(xì)胞的樣本中提取的腫瘤細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)形成的，可以在一定程度上重現(xiàn)原始腫瘤病理形態(tài)、遺傳特征和治療反應(yīng)特征的腫瘤類器官。3.3人肝內(nèi)膽管癌類器官patient-derivedorganoidsforintrahepaticcholangiocarcinoma由《人原發(fā)性肝癌診斷指南》2022為依據(jù)診斷為肝內(nèi)膽管癌的患者的手術(shù)切除組織體外3D培養(yǎng)而成的，在遺傳特征、特征基因表達(dá)上與肝內(nèi)膽管癌具有相似生物學(xué)特性的類器官培養(yǎng)物。3.4傳代passage體外培養(yǎng)的類器官經(jīng)過物理、化學(xué)或酶消化處理的方法，將原有類器官分成更小細(xì)胞簇甚至是單細(xì)胞懸液，重新接種到與原培養(yǎng)條件相同的新培養(yǎng)體系中進(jìn)行體外培養(yǎng)的過程，新接種的類器官將與原培養(yǎng)物具有相同的結(jié)構(gòu)形態(tài)及遺傳特征。3.5凍存cryopreservation2類器官暫時(shí)脫離生長狀態(tài)并保持其細(xì)胞組成、基因表達(dá)特征及功能特性的低溫凍存過程。3.6復(fù)蘇thawing將處于深低溫凍存的類器官取出迅速恢復(fù)至培養(yǎng)溫度，使其繼續(xù)維持正常生長狀態(tài)的過程。3.73D培養(yǎng)基質(zhì)膠3Dextracellularmatrixgel由層黏連蛋白、IV型膠原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等組成。3D培養(yǎng)基質(zhì)膠在室溫條件下能夠聚合形成具有生物學(xué)活性的三維基質(zhì)，模擬體內(nèi)細(xì)胞基底膜結(jié)構(gòu)和功能，為體外類器官的培養(yǎng)和分化提供支架。3.8細(xì)胞計(jì)數(shù)cellcounting使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或血球計(jì)數(shù)板對(duì)組織消化成的單細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)的過程，通常在腫瘤組織接種前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。3.9知情同意informedconsent指組織提供者被告知組織提供后的各種情況（包括但不限于研究應(yīng)用、風(fēng)險(xiǎn)、獲益等）后，確認(rèn)同意捐贈(zèng)組織的過程。該過程應(yīng)當(dāng)以書面的、簽署姓名和日期的知情同意書作為文件證明。4縮略語下列縮略語適用于本文本。HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）HIV：人免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）TP：梅毒螺旋體（TreponemaPallidum）STR：短串重復(fù)序列（ShortTandemRepeat）5倫理要求5.1人肝內(nèi)膽管癌類器官來源組織的采集、處理以及應(yīng)用等應(yīng)獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。5.2組織采集前應(yīng)與供者簽署書面的合法有效的知情同意通知書，始終秉承“尊重、公正、互惠、不傷害”的倫理原則，充分告知，包括但不限于：可能影響構(gòu)建成功的因素及成功率、合適條件下潛在研究及治療的應(yīng)用、研究成果潛在的商業(yè)應(yīng)用及其他問題所適用的內(nèi)容。5.3應(yīng)對(duì)類器官原組織提供者個(gè)人信息進(jìn)行隱私保護(hù)，保障供者的利益、國家生物樣本安全和信息安全。6場地及環(huán)境要求6.1實(shí)驗(yàn)室設(shè)施和設(shè)備要求應(yīng)符合《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》GB19489現(xiàn)行版本的BSL-2及以上的技術(shù)要求，潔凈程度應(yīng)滿足“C+A”及以上潔凈度要求。6.2必要時(shí)對(duì)相鄰區(qū)域進(jìn)行有效隔離，采取相應(yīng)措施避免交叉污染。7樣本采集37.1應(yīng)建立樣本采集的供者評(píng)估和篩選標(biāo)準(zhǔn)、采集方法、運(yùn)輸標(biāo)準(zhǔn)和交接標(biāo)準(zhǔn)，保證供者和組織的安全。需提供樣本的獲取方式和途徑以及相關(guān)的臨床資料，包括供者的一般信息、既往病史、家族史等。既往史和家族史要對(duì)遺傳?。▎位蚝投嗷蚣膊。ㄐ难芗膊『湍[瘤等）相關(guān)信息進(jìn)行詳細(xì)采集。7.2供體應(yīng)篩查確認(rèn)無HIV、HBV、HCV、TP等外源病毒因子等感染。7.3樣本的采集與處理應(yīng)由接受過專業(yè)培訓(xùn)的醫(yī)護(hù)人員/工作人員進(jìn)行。7.4腫瘤組織切取時(shí)以供血豐富區(qū)域?yàn)榧?，?yīng)避開有明顯壞死、灼燒和電刀損傷區(qū)域，且組織塊應(yīng)不小于5mm×5mm（每塊不小于0.5g）。新鮮組織應(yīng)在離體30min內(nèi)切取，并置于保存液中并盡快處理，保存時(shí)間不建議超過2小時(shí)。7.5采集的每個(gè)樣本應(yīng)有唯一的標(biāo)識(shí)符，以確保在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后的整個(gè)培養(yǎng)鑒定過程均可以識(shí)別其身份。8肝內(nèi)膽管癌類器官的構(gòu)建、傳代、凍存、復(fù)蘇及處置8.1肝內(nèi)膽管癌類器官構(gòu)建肝內(nèi)膽管癌腫瘤組織經(jīng)過清洗、酶消化成單細(xì)胞，用基質(zhì)膠和完全培養(yǎng)基的混合物重懸后接種至24孔板中，進(jìn)行原代培養(yǎng)。詳細(xì)步驟參見附錄B。8.2肝內(nèi)膽管癌類器官傳代肝內(nèi)膽管癌腫瘤組織分離培養(yǎng)的類器官稱為原代類器官，原代類器官體外培養(yǎng)一般不超過14天。原代類器官達(dá)到一定數(shù)目和體積后酶消化為單細(xì)胞或更小細(xì)胞簇，然后接種至新的基質(zhì)膠與培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。詳細(xì)步驟參見附錄B。8.3肝內(nèi)膽管癌類器官凍存暫不使用的肝內(nèi)膽管癌類器官消化為單細(xì)胞或更小細(xì)胞簇后，加入凍存保護(hù)劑，經(jīng)程序降溫后，轉(zhuǎn)移至液氮環(huán)境中凍存。詳細(xì)步驟參見附錄B。8.4肝內(nèi)膽管癌類器官復(fù)蘇肝內(nèi)膽管癌類器官復(fù)蘇遵循速融原則。使用37℃水浴令其盡快融化，融化后接種至新的基質(zhì)膠與培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)和傳代，培養(yǎng)基組成應(yīng)與凍存前培養(yǎng)基組成相同。8.5肝內(nèi)膽管癌廢棄類器官處置肝內(nèi)膽管癌類器官構(gòu)建和傳代過程中產(chǎn)生的廢棄物、不合格的或者污染的類器官應(yīng)遵循生物醫(yī)療廢棄物處理規(guī)范，送至有醫(yī)療廢棄物處理資質(zhì)的企業(yè)進(jìn)行廢棄處理。廢棄物處置過程應(yīng)嚴(yán)格按照生物樣本處置與管理規(guī)范操作。9關(guān)鍵參數(shù)及檢測(cè)方法9.1形態(tài)人肝內(nèi)膽管癌類器官在倒置光學(xué)顯微鏡4倍物鏡下可見邊緣清晰的囊泡型結(jié)構(gòu)和多細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)。傳代后類器官均呈囊泡型生長，囊泡的平均直徑應(yīng)控制在50~75μm。9.2存活率4將消化離心后的細(xì)胞沉淀用AdvancedDMEM/F12培養(yǎng)基重懸，對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以活細(xì)胞比例＞80%表示制備的細(xì)胞活力良好。類器官單細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)不宜低于1×106cells/ml。計(jì)數(shù)方法詳見附件A。9.3體外培養(yǎng)及生長9.3.1從肝膽管癌患者來源的肝膽管癌組織或細(xì)胞，初次在體外培養(yǎng)成人原代肝膽管癌類器官后，應(yīng)能在體外維持培養(yǎng)2個(gè)月，且應(yīng)能在體外多次傳代。9.3.2當(dāng)類器官傳代后，應(yīng)能進(jìn)行體外重建成為新的類器官，重建的類器官和傳代前類器官的形態(tài)特征應(yīng)保持一致。9.4數(shù)量體外三維培養(yǎng)類器官可通過倒置顯微鏡進(jìn)行拍照，顯微鏡附帶比例尺進(jìn)行類器官的直徑測(cè)量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。類器官的個(gè)數(shù)可進(jìn)行直接計(jì)數(shù)。9.5微生物按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“1101無菌檢查法”進(jìn)行真菌和細(xì)菌檢測(cè)，結(jié)果應(yīng)為陰按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“3301支原體檢查法”進(jìn)行支原體檢測(cè)，結(jié)果應(yīng)為陰性。按照WS293核酸法檢測(cè)、WS299核酸法、WS213核酸法檢測(cè)HBV、HCV、HIV結(jié)果均應(yīng)為陰性。按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“3302外源病毒因子檢查法”檢測(cè)外源病毒因子，結(jié)果均應(yīng)為陰性。9.6STR體外培養(yǎng)的類器官，可自行或送至有鑒定資質(zhì)的檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行STR檢測(cè)及分型鑒定。類器官應(yīng)與供體STR分型一致。9.7病理特征9.7.1類器官染色后，由具備病理鑒定資質(zhì)的專業(yè)人員進(jìn)行判定，其組成細(xì)胞應(yīng)具有腫瘤細(xì)胞的特異性特征如核深染、異常核分裂象、核質(zhì)比失調(diào)等。9.7.2人肝內(nèi)膽管癌類器官的免疫組化標(biāo)志蛋白包括上皮標(biāo)志性蛋白EPCAM、膽管標(biāo)志性蛋白CK7和CK19，細(xì)胞干性蛋白LGR5、SOX9應(yīng)呈陽性且表達(dá)分布不具極性，與原始腫瘤表達(dá)一致。具體操作步驟詳見附錄A。9.8遺傳特征應(yīng)對(duì)類器官進(jìn)行基因變異檢測(cè)，檢測(cè)的基因應(yīng)包括但不局限于KMT2C、PTCHD3、FMN2、USP2、ARID1B、RTK、HDAC5等，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)與原腫瘤組織的基因變異結(jié)果一致。10生物安全在樣本采集、培養(yǎng)、保藏及鑒定過程中涉及生物安全相關(guān)內(nèi)容的，應(yīng)遵守《中華人民共和國生物安全法》的相關(guān)規(guī)定。（規(guī)范性）肝內(nèi)膽管癌類器官鑒定A.1單細(xì)胞懸液細(xì)胞定量評(píng)估在類器官傳代前應(yīng)用消化酶消化成單細(xì)胞懸液?？墒褂米詣?dòng)化細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。將離心后的細(xì)胞沉淀充分拍打均勻（因肝膽管癌細(xì)胞黏性較大，不容易混勻），之后用5mLAdvancedDMEM/F12培養(yǎng)基重懸，經(jīng)吹打混勻后吸取20μl細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以活細(xì)胞比例＞80%表示制備的細(xì)胞活力良好。類器官單細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)不宜低于1.5×106cells/ml。人工使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的方案同樣適用。A.2肝膽管癌類器官的形態(tài)學(xué)及免疫標(biāo)記鑒定肝膽管癌類器官成功構(gòu)建后，通過制備冰凍切片或者石蠟包埋切片，蘇木素/伊紅染色（H&E）進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，通過免疫熒光或者免疫組化染色進(jìn)行生物標(biāo)志物檢測(cè)，從而確定類器官是否來源于肝膽管癌。肝膽管癌類器官可以不同程度地表達(dá)EPCAM、CK7和CK19、LGR5、SOX9。6（規(guī)范性）肝內(nèi)膽管癌類器官構(gòu)建、傳代及凍存步驟B.1肝內(nèi)膽管癌原代分離培養(yǎng)操作步驟去除標(biāo)本上的壞死組織及脂肪組織，將樣本在含200U/mL青鏈霉素的AdvancedDMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中洗滌2次以上，然后將組織盡量剪碎至1mm3左右大小；將剪碎的組織加入終濃度為2.5mg/mLCollagenaseIV和0.1mg/mLDNaseI的預(yù)熱組織消化液中，放置于水浴鍋中進(jìn)行消化。待大部分組織消化完全后，向上述消化液中加1-3倍體積的AdvancedDMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基或者1-3倍體積Hank‘s終止消化，將上述液體過100μm細(xì)胞篩后180×g離心5min；用AdvancedDMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸清洗一次，獲得單細(xì)胞懸液，再次離心獲得沉淀。將上述沉淀用AdvancedDMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸，之后加入等體積已經(jīng)融化的基質(zhì)膠充分混合均勻，在24孔板中每孔接種50μL，置于培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)3～5min，待半凝固后倒置10～15min，待其完全凝固后加入完全培養(yǎng)基進(jìn)行正置培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基組成詳見表1。上述培養(yǎng)物每隔2天進(jìn)行全量換液。B.2傳代及凍存顯微鏡下觀察待每孔出現(xiàn)數(shù)個(gè)直徑大于50μm的類器官囊泡時(shí)，吸棄完全培養(yǎng)基，每孔加入500μL37℃預(yù)熱的TrypLE消化液，轉(zhuǎn)移至離心管中，37℃孵育5min，加入終止液終止。600×g離心5min，凍存時(shí)沉淀用凍存液重懸后進(jìn)行程序降溫后轉(zhuǎn)至液氮存儲(chǔ)。傳代時(shí)沉淀處理步驟參照B.1中最后一步用AdvancedDMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸后接種及換液程序進(jìn)行。B.3復(fù)蘇培養(yǎng)凍存類器官在37℃水浴中解凍，放入完全培養(yǎng)基稀釋后600×g離心5min，去除上清后離心留存沉淀。用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后，用基質(zhì)膠和完全培養(yǎng)基混合重懸后按照步驟2程序接種至孔板中。表1肝內(nèi)膽管癌類器官完全培養(yǎng)基主要成分8參考文獻(xiàn)[1]T/CSCB001-2020干細(xì)胞通用要求[2]T/CSCB0014-2022人腸癌類器官[3]國家衛(wèi)生健康委，涉及人的生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究倫理審查辦法，2023[4]中國抗癌協(xié)會(huì)腫瘤多學(xué)科診療專業(yè)委員會(huì)，中國抗癌協(xié)會(huì)腫瘤內(nèi)分泌專業(yè)委員會(huì).腫瘤類器官診治平臺(tái)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中國專家共識(shí)（2022年版J］.中國癌癥雜志,20