細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法講義

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

常勝凱藥理室背景介紹：一、細(xì)菌內(nèi)毒素二、熱原三、鱟一、細(xì)菌內(nèi)毒素細(xì)菌內(nèi)毒素是一種革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的產(chǎn)物，當(dāng)其死亡或菌體裂解時釋放出的一類具有多種生物活性的毒性物質(zhì)特性：（1）.致熱性：內(nèi)毒素作用人體細(xì)胞，使之釋放內(nèi)源性熱原，刺激下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，引起發(fā)熱反應(yīng)。（2）.耐熱性：需250度干熱30分鐘才能徹底滅活。（3）.分子極性：多糖鏈親水，脂肪鏈?zhǔn)杷谒谐什痪鶆蚍植?。?）.鱟反應(yīng)：能與鱟試劑發(fā)生多級酶促反應(yīng)，形成凝膠。二、熱原熱原是指臨床上引起哺乳動物發(fā)熱反應(yīng)的物質(zhì)

細(xì)胞分裂素（IL-1,IL-2,IL-6,IL-8

）內(nèi)源性熱原產(chǎn)生細(xì)胞分裂素的物質(zhì)

內(nèi)毒素?zé)嵩庠葱詿嵩莾?nèi)毒素?zé)嵩ú《?、?xì)菌、真菌、抗體-抗原復(fù)合物、細(xì)胞分裂素）熱原和內(nèi)毒素的關(guān)系：熱原是否就是內(nèi)毒素？在學(xué)術(shù)上仍有爭議，熱原不僅是細(xì)菌內(nèi)毒素。但在藥檢的范疇，細(xì)菌內(nèi)毒素是主要的熱原物質(zhì)，可以說無內(nèi)毒素就無熱原，控制內(nèi)毒素就是控制熱原。三、鱟鱟(horseshoecrab)是一類與三葉蟲(現(xiàn)在只有化石)一樣古老的動物。鱟的祖先出現(xiàn)在地質(zhì)歷史時期古生代的泥盆紀(jì)，當(dāng)時恐龍尚未崛起，原始魚類剛剛問世，隨著時間的推移，與它同時代的動物或者進化、或者滅絕，而惟獨只有鱟從4億多年前問世至今仍保留其原始而古老的相貌，所以鱟有“活化石”之稱。又具有很高的藥用價值。鱟鱟試劑鱟的血液中含有銅離子，它的血液是藍(lán)色的。鱟血液顏色呈藍(lán)色，是因為鱟血漿的主要成分是血藍(lán)蛋白。這種藍(lán)色血液的提取物——“鱟試劑”。鱟試劑是由海洋生物鱟的血液提取物制成的“鱟試劑”，能夠準(zhǔn)確、快速地檢測人體是否因細(xì)菌感染而致病；鱟試劑在制藥行業(yè)中，用于檢測細(xì)菌內(nèi)毒素。目前使用的鱟試劑分為美洲鱟試劑和東方鱟鱟試劑兩大類。2010年版藥典細(xì)菌內(nèi)毒素

檢查法介紹整體結(jié)構(gòu)1.綜述部分檢查法的描述試驗的準(zhǔn)備限值（L）的確定確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）2.實驗部分凝膠法 光度測定法a鱟試劑靈敏度復(fù)核 a標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性實驗b干擾實驗 b干擾實驗c檢查法：限量試驗 c檢查法半定量試驗 綜述部分1.檢查法的描述2.試驗的準(zhǔn)備3.限值（L）的確定4.確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的定義：本法是利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝聚反應(yīng)的機理，以判斷供試品中的細(xì)菌內(nèi)毒素限度是否符合規(guī)定的一種方法。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法介紹細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括：限量實驗?zāi)z法半定量實驗可使用其中任何一種方法進行試驗。當(dāng)測定結(jié)果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。

濁度法動態(tài)濁度法光度測定法終點濁度法顯色基質(zhì)法動態(tài)顯色法終點顯色法

試驗的準(zhǔn)備實驗所需物品細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水凝膠法鱟試劑漩渦混合器適宜的恒溫器37±1℃電熱干燥箱250℃實驗器械等細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)a國家標(biāo)準(zhǔn)品

以內(nèi)毒素國際標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定效價。系自大腸埃系菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價。150600-20070710000EU/支b工作標(biāo)準(zhǔn)品

以內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定效價。用于試驗中鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗及各種陽性對照。150601-200968150EU/支150601-201072120EU/支細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水用于復(fù)溶內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋內(nèi)毒素及樣品、溶解鱟試劑等a凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水b光度測定法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，其內(nèi)毒素含量應(yīng)小于0.005EU/ml漩渦混合器漩渦混合器干熱恒溫器恒溫水浴試驗器械移液管（或刻度吸管、微量加樣器及無熱原吸頭）、凝集管（10×75mm）、試管、試管架、洗耳球、封口膜、計時器、75%酒精棉、剪刀、砂輪。試驗的準(zhǔn)備

試驗的準(zhǔn)備

試驗器械的要求試驗所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。常用的方法是在250℃干烤至少30分鐘，也可采用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無內(nèi)毒素并且對試驗無干擾的器械。試驗操作過程應(yīng)防止微生物是污染。試驗的準(zhǔn)備供試品溶液的制備某些供試品需進行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的pH值在6.0～8.0的范圍內(nèi)。對于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需調(diào)節(jié)被測溶液（或其稀釋液）的pH值，可使用酸、堿溶液或鱟試劑生產(chǎn)廠家推薦的適宜的緩沖液調(diào)節(jié)pH值。緩沖液必須經(jīng)過驗證不含內(nèi)毒素和干擾因子。限值（L）的確定藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）除藥典有規(guī)定的，一般按以下公式確定：

L＝K／MK為人每千克體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/(kg·h)表示，注射劑K=5EU/(kg·h)，放射性藥品注射劑K=2.5EU/(kg·h)，鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU/(kg·h)；M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，以ml/(kg·h)、mg/(kg·h)或U/(kg·h)表示，人均體重按60kg計算，人體表面積按1.62㎡計算。注射時間若不足1小時，按1小時計算。供試品每平方米體表面積劑量乘以0.027即可轉(zhuǎn)換為每千克體重劑量（M）按人用劑量計算限值時，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實際情況做必要調(diào)整，但需說明理由。限值計算時做必要調(diào)整的幾種情況從嚴(yán)原則聯(lián)合用藥特殊情況等限值（L）的確定確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）

最大有效稀釋倍數(shù)是指供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進行內(nèi)毒素限值的檢測。MVD＝cL／λ

L：供試品的內(nèi)毒素限值

c：供試品溶液的濃度

λ：在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度(EU/ml)，或在光度測定法中所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低的內(nèi)毒素濃度(如標(biāo)準(zhǔn)曲線為50、5、

0.5EU/ml三個濃度組成)計算舉例a當(dāng)L以EU/ml表示時，則濃度C的單位為1.0ml/ml

適用于供試品為溶液狀態(tài)，并且規(guī)定限值為應(yīng)小于xxEU/ml。

例：替硝唑注射液，計算限值為0.5EU/ml，使用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進行檢驗，則：MVD＝1.0ml/ml×0.5EU/ml÷0.125EU/ml＝4倍確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）

計算舉例b當(dāng)L以EU/mg表示時，則C的單位為mg/ml或U/ml適用于供試品為固體狀態(tài)，如粉針；或液體但是規(guī)定限值為應(yīng)小于xxEU/mg或EU/U。例：注射用阿莫西林鈉計算限值為0.15EU/mg，使用靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑進行檢驗。需先稱取一定重量的注射用阿莫西林鈉，在已除去外源性內(nèi)毒素的容器中，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水配制成一定濃度的溶液。如稱取100mg注射用阿莫西林鈉，用5ml內(nèi)毒素檢查用水溶解，即成為濃度為20mg/ml的阿莫西林鈉溶液。MVD＝20mg/ml×0.15EU/mg÷0.25EU/ml＝12倍如果供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD

取1，計算供試品的最小有效稀釋濃度c=λ/L

；適用于供試品為固體的情況。計算得到的最小有效稀釋濃度即為MVD下的該供試品的濃度。

例：注射用阿莫西林鈉計算限值為0.15EU/mg，使用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進行檢驗。最小有效稀釋濃度c

＝0.125EU/ml÷0.15EU/mg＝0.833mg/ml實驗部分

凝膠法光度測定法a鱟試劑靈敏度復(fù)核a標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性實驗b干擾實驗b干擾實驗c檢查法：限量試驗c檢查法

半定量試驗?zāi)康模疾祺c試劑的靈敏度是否準(zhǔn)確－考察檢驗人員操作方法是否正確－實驗條件是否符合規(guī)定何時進行－使用新批號的鱟試劑－試驗條件發(fā)生可能影響檢驗結(jié)果的改變時

鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗實驗操作:取細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品或工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，加入規(guī)定量的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴(yán)，置旋渦混合器上混合15分鐘。然后進行稀釋，制備成4個濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ（λ為所復(fù)核的鱟試劑的標(biāo)示靈敏度），每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30秒鐘。鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗

內(nèi)毒素濃度2λλ0.5λ0.25λ陰性對照鱟試劑平行管○○○○○○○○○○○○○○○○○○鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗放入37℃±1℃的恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；形成的凝膠不堅實、變形或從管壁滑脫者為陰性；保溫和拿取試管過程應(yīng)避免受到振動造成假陰性結(jié)果。堅實凝膠陽性“+”未形成凝膠凝膠不堅實陰性“—”結(jié)果判斷：若最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照管陰性，試驗方有效。結(jié)果計算：反應(yīng)終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值λc=lg-1(ΣX/4)

式中X為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值（lg）。（反應(yīng)終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。）鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗內(nèi)毒素濃度2λλ0.5λ0.25λ陰性對照終點鱟試劑平行管●●○○○λ●●○○○λ●●●○0.5λ●●●○0.5λλc=lg-1[(lgλ+lgλ+lg0.5λ+lg0.5λ)/4]=0.707λ當(dāng)λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）時，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。實驗時，以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗?zāi)z法干擾試驗?zāi)康模菏谴_定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)不存在干擾作用，為能否使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。凝膠法干擾試驗當(dāng)進行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗前，或無內(nèi)毒素檢查項的品種建立內(nèi)毒素檢查法時，須進行干擾試驗。（注：須三個批號以上的供試品，兩個以上鱟試劑廠家的試劑）當(dāng)鱟試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須重新進行干擾試驗。如：內(nèi)毒素檢查時，供試品陽性對照為陰性時。凝膠法干擾試驗預(yù)試驗正式干擾試驗?zāi)康模撼醪酱_定供試品的最大不干擾濃度（當(dāng)限值以EU/mg或EU/U活性單位表示）或最小不干擾稀釋倍數(shù)（當(dāng)限值以EU/ml表示），為正式干擾實驗提供依據(jù)；優(yōu)點：減少摸索過程、節(jié)省成本。預(yù)試驗操作步驟：將供試品溶液進行一系列倍數(shù)的稀釋；使用鱟試劑對每一稀釋倍數(shù)進行檢驗，每一稀釋倍數(shù)下做2支供試品管和4支供試品陽性對照（即含2.0λ和0.25λ濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的該濃度的供試品稀釋液）；另做2支陰性對照和2支陽性對照。預(yù)試驗預(yù)試驗結(jié)果判斷：當(dāng)陰性對照為陰性，陽性對照為陽性時，實驗為有效；當(dāng)系列濃度中出現(xiàn)供試品溶液2管為陰性，供試品陽性對照2管為陽性時，供試品陽性對照0.25λ管均為陰性時，認(rèn)為供試品在該濃度下不干擾實驗，此稀釋倍數(shù)即為最小不干擾稀釋倍數(shù)。即可選擇該稀釋倍數(shù)和相鄰濃度進行正式干擾實驗。預(yù)試驗正式干擾試驗

目的：檢驗在某一濃度下的供試品對于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有無干擾作用。通過比較鱟試劑與在水溶液中的內(nèi)毒素和供試品溶液中的內(nèi)毒素反應(yīng)的差異程度，來確定供試品在該濃度下是否對內(nèi)毒素檢查有干擾。正式干擾試驗操作：用內(nèi)毒素檢查用水和供試品將同一支內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品分別制備一系列濃度的內(nèi)毒素溶液操作：內(nèi)毒素檢查用水同一支內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品供試品溶液同時制備2支供試品陰性對照和2支陰性對照。

含2.0λ、λ、0.5λ、0.25λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液含2.0λ、λ、0.5λ、0.25λ的內(nèi)毒素的供試品溶液

編號內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶劑稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液－－－2B2λ/供試品溶液供試品溶液12λ421λ440.5λ480.25λ4C2λ/檢查用水檢查用水12λ421λ440.5λ480.25λ4D無/檢查用水－－－2A：供試品溶液B：供試品陽性對照C：陽性對照D：陰性對照結(jié)果判斷當(dāng)供試品陰性對照A和陰性對照D都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果在鱟試劑靈敏度范圍內(nèi)時，試驗方為有效。分別計算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（ES）和用供試品溶液和稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（Et）；

ES=lg-1(ΣXS/4)Et=lg-1(ΣXt/4)當(dāng)ES在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5ES～

2ES（包括0.5ES和2ES）時，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。內(nèi)毒素濃度2.0λλ0.5λ0.25λ終點內(nèi)毒素/檢查用水（系列溶液C）●●○○λ●●○○λ●●○○λ●●○○λ陰性對照（溶液D）○○內(nèi)毒素/供試品溶液（系列溶液B）●●○○λ●●○○λ●○○○2.0λ●○○○2.0λ供試品陰性對照（溶液A）○○

ES=lg-1(ΣXS/4)＝λEt=lg-1(ΣXt/4)＝1.41λ當(dāng)存在干擾時，可通過對供試品進行更大倍數(shù)的稀釋或有關(guān)其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。導(dǎo)致干擾的因素：排除干擾的方法：pH值稀釋抗凝因子中和螯合劑過濾葡聚糖加熱凝膠法干擾試驗由于干擾實驗檢驗的是在供試品存在的情況下內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)是否正常，與所使用鱟試劑的靈敏度無關(guān)，因此在干擾實驗中原則上可使用任一靈敏度的鱟試劑。建議使用較低靈敏度（如0.5或0.25EU/ml）的鱟試劑，可盡量避免供試品所含的內(nèi)毒素對干擾實驗造成的陽性影響。檢查法－凝膠法凝膠限度試驗?zāi)z半定量試驗?zāi)z限度試驗檢驗供試品中的內(nèi)毒素含量是否小于限度的定性方法。編號內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A供試品溶液無/供試品溶液2B供試品陽性對照2λ/供試品溶液2C陽性對照2λ/檢查用水2D陰性對照無/檢查用水2當(dāng)陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性，陽性對照溶液C的平行管均為陽性，試驗有效例：替硝唑注射液，計算限值為0.5EU/ml，使用靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑進行檢驗，計算：

MVD＝1.0ml/ml×0.5EU/ml÷0.25EU/ml＝2倍供試品溶液：2倍替硝唑稀釋液供試品陽性對照為：含0.25EU/ml標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的2倍替硝唑稀釋液陽性對照為：濃度為0.25EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液凝膠限度試驗結(jié)果判斷供試品溶液供試品陽性對照陰性對照陽性對照○○●●○○●●試驗有效凝膠限量試驗結(jié)果判斷供試品溶液供試品陽性對照陰性對照陽性對照○○●●○○●●此批替硝唑注射液的內(nèi)毒素含量小于0.5EU/ml，符合規(guī)定供試品溶液供試品陽性對照陰性對照陽性對照●●●●○○●●此批替硝唑注射液的內(nèi)毒素含量不小于0.5EU/ml，不符合規(guī)定凝膠限量試驗結(jié)果判斷供試品溶液供試品陽性對照陰性對照陽性對照○●●●○○●●須復(fù)試復(fù)試時，供試品溶液需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判供試品符合規(guī)定；四管中如有一管為陽性，即可判供試品不符合規(guī)定。供試品溶液供試品陽性對照陰性對照陽性對照○○○○●●○○●●凝膠半定量試驗半定量試驗是使用凝膠法估測供試品中內(nèi)毒素含量的方法，系通過反應(yīng)終點濃度來量化供試品中內(nèi)毒素的含量。原理：通過供試品系列稀釋液與鱟試劑反應(yīng)，其反應(yīng)終點濃度的稀釋倍數(shù)與鱟試劑靈敏度的乘積即為供試品的內(nèi)毒素含量。凝膠半定量試驗操作：用檢查用水將供試品溶液從已確定的不干擾濃度和稀釋倍數(shù)下開始進行對倍稀釋，制備成2、4、8倍的稀釋液，但最大稀釋倍數(shù)不得超過所使用鱟試劑的MVD。凝膠半定量試驗溶液的制備編號內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶劑稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液檢查用水1－22－24－28－2B2λ/供試品溶液2λ2C2λ/檢查用水檢查用水12λ221λ240.5λ280.25λ2D無/檢查用水－－－2A：沒有超過MVD并且通過干擾試驗的供試品系列稀釋液；B：供試品陽性對照（為確證不存在干擾作用）；C：標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素系列（為確證本試驗的操作和環(huán)境都符合規(guī)定）；D：陰性對照。凝膠半定量試驗－結(jié)果判斷當(dāng)陰性對照溶液D的平行管均為陰性；供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性；系列溶液C的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值在0.5λ～2λ之間，則試驗有效。若內(nèi)毒素濃度小于規(guī)定的限度，判供試品符合規(guī)定。若內(nèi)毒素濃度大于或等于規(guī)定的限度，判供試品不符合規(guī)定。凝膠半定量試驗－結(jié)果計算內(nèi)毒素濃度2.0λλ0.5λ0.25λ終點標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素系列溶液C●●●○0.5λ●●○○λ稀釋倍數(shù)1248供試品系列溶液A●●●○4×λ●●○○2×λ供試品陽性對照溶液B●●陰性對照溶液D○○CE＝lg-1(ΣX/2)=lg-1[(lg4λ+lg2λ)/2]=2.83λ例：右旋糖酐20葡萄糖注射液，限值為0.5EU/ml；通過使用3個鱟試劑廠家的鱟試劑對3個不同廠家的7個樣品進行干擾試驗證實：右旋糖酐20葡萄糖注射液稀釋2倍后即不干擾內(nèi)毒素檢查；使用靈敏度為0.03EU/ml的鱟試劑對一批右旋糖酐20葡萄糖注射液進行凝膠半定量試驗。MVD＝0.5EU/ml÷0.03EU/ml＝16.67倍從已確定不干擾的稀釋倍數(shù)2倍起，再進行1、2、4、8倍稀釋(相當(dāng)于將供試品原液進行了2、4、8、16倍稀釋，最終的稀釋倍數(shù)沒有超MVD)。內(nèi)毒素濃度0.060.030.0150.0075終點標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素系列溶液C●●●○0.015●●○○0.03稀釋倍數(shù)1248供試品系列溶液A●●●○4×0.03●●○○2×0.03供試品陽性對照溶液B●●陰性對照溶液D○○CE＝lg-1(ΣX/2)=lg-1[(lg4λ+lg2λ)/2]=2.83λ＝0.0849E