《細(xì)胞純度測定通 用要求+流式細(xì)胞測定法GBT+39729-2020》詳細(xì)解讀

《細(xì)胞純度測定通用要求流式細(xì)胞測定法GB/T39729-2020》詳細(xì)解讀contents目錄1范圍2規(guī)范性引用文件3術(shù)語、定義和縮略語4方法原理5通用要求5.1試劑或材料5.2儀器設(shè)備contents目錄5.3樣本制備5.4試驗步驟5.5數(shù)據(jù)分析5.6方法確認(rèn)5.7報告參考文獻(xiàn)011范圍010203本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了流式細(xì)胞測定法用于細(xì)胞純度測定的通用要求。適用于科研、臨床、生物制藥及細(xì)胞治療等領(lǐng)域中對細(xì)胞純度進行測定的流式細(xì)胞測定法。適用于單一樣本中特定細(xì)胞群體的純度測定，如腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞等。測定方法的適用范圍測定對象的范圍測定對象包括但不限于：培養(yǎng)的細(xì)胞、組織樣本解離得到的單細(xì)胞懸液、血液中分離得到的細(xì)胞等。01適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞的純度測定。02可用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的純度測定，但需注意固定過程可能對細(xì)胞表面標(biāo)記物的影響。03測定結(jié)果應(yīng)準(zhǔn)確反映樣本中目標(biāo)細(xì)胞的純度，以百分比表示。測定結(jié)果還可為細(xì)胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量控制和療效評估提供依據(jù)。測定結(jié)果可用于比較不同樣本間細(xì)胞純度的差異，或用于監(jiān)測細(xì)胞分離、培養(yǎng)等過程中的純度變化。測定結(jié)果的表述范圍022規(guī)范性引用文件《GB/T6379.1測量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度(正確度與精密度)第1部分：總則與定義》《GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定》《GB/T6379.6測量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度(正確度與精密度)第6部分：準(zhǔn)確度值的實際應(yīng)用》《GB/T27405實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》國家標(biāo)準(zhǔn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《YY/T0681.1體外診斷試劑用校準(zhǔn)品和質(zhì)控品第1部分：制備和定值通用要求》《YY/T0681.2-2008體外診斷試劑用校準(zhǔn)品和質(zhì)控品物質(zhì)量的賦值》““《ISO15189:2012醫(yī)學(xué)實驗室-質(zhì)量和能力的要求》國際標(biāo)準(zhǔn)“《中國合格評定國家認(rèn)可委員會實驗室認(rèn)可準(zhǔn)則》（CNAS-CL012018）（等同采用ISO/IEC17025：2017）（注以上列舉的引用文件僅為示例，實際標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件可能有所不同。）參考文件033術(shù)語、定義和縮略語流式細(xì)胞儀一種能夠自動分析和分選細(xì)胞的儀器，通過激光激發(fā)細(xì)胞上的熒光標(biāo)記或細(xì)胞自身的熒光特性，對細(xì)胞進行快速、準(zhǔn)確的定量分析和分選。細(xì)胞純度細(xì)胞周期術(shù)語和定義指樣本中目標(biāo)細(xì)胞所占的比例，是衡量細(xì)胞制備質(zhì)量的重要指標(biāo)。指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，分為G1期、S期、G2期和M期。PE藻紅蛋白（Phycoerythrin），一種從紅藻中提取的熒光蛋白，常用作熒光標(biāo)記物，與FITC等染料相比，其發(fā)射波長更長，可避免光譜重疊。FCS流式細(xì)胞分選（FluorescenceActivatedCellSorting）PI碘化丙啶（PropidiumIodide），一種常用的DNA染料，用于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。FITC異硫氰酸熒光素（FluoresceinIsothiocyanate），一種常用的熒光染料，可用于標(biāo)記抗體等生物分子，便于流式細(xì)胞儀檢測。縮略語044方法原理4.1流式細(xì)胞測定法概述流式細(xì)胞測定法是一種基于流式細(xì)胞儀的檢測技術(shù)，用于快速分析和分選細(xì)胞。該技術(shù)通過激光激發(fā)細(xì)胞上的熒光標(biāo)記物，利用光電倍增管等檢測器檢測熒光信號，從而對細(xì)胞進行定量分析和分選。流式細(xì)胞DNA分析利用流式細(xì)胞儀對單個細(xì)胞的DNA含量進行快速、準(zhǔn)確的定量分析。通過特定熒光染料與DNA結(jié)合，測量細(xì)胞熒光強度，從而確定DNA含量，進而分析細(xì)胞周期、倍體等信息。4.2流式細(xì)胞DNA分析的原理流式細(xì)胞儀可快速檢測大量細(xì)胞，提高檢測效率。高通量能夠檢測到微弱的熒光信號，準(zhǔn)確反映細(xì)胞特性。高靈敏度同時檢測多個熒光信號，獲取豐富的細(xì)胞信息。多參數(shù)分析4.3方法優(yōu)勢01020301細(xì)胞周期分析通過測定DNA含量，了解細(xì)胞增殖狀態(tài)，為生物醫(yī)學(xué)研究提供重要數(shù)據(jù)。4.4應(yīng)用范圍02腫瘤研究檢測腫瘤細(xì)胞DNA含量變化，有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和診斷。03藥物篩選評估藥物對細(xì)胞周期的影響，為藥物研發(fā)提供有力支持。055通用要求實驗室溫度應(yīng)控制在適宜范圍內(nèi)，以保證儀器和試劑的穩(wěn)定性。實驗室應(yīng)具備適當(dāng)?shù)陌踩胧ǚ阑?、防電擊等。實驗室?yīng)保持清潔，避免塵埃和微生物污染。5.1實驗室環(huán)境010203流式細(xì)胞儀應(yīng)定期校準(zhǔn)和維護，確保其準(zhǔn)確性和可靠性。使用的所有儀器和設(shè)備應(yīng)符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)定。實驗室應(yīng)備有必要的備用設(shè)備和零部件，以應(yīng)對可能的故障。5.2儀器與設(shè)備使用的試劑和材料應(yīng)具有高純度，并經(jīng)過質(zhì)量驗證。5.3試劑與材料試劑的儲存和使用應(yīng)遵循制造商的說明。應(yīng)定期檢查試劑的有效期和穩(wěn)定性。5.4操作人員操作人員應(yīng)接受過專業(yè)培訓(xùn)，并具備相應(yīng)的技能和經(jīng)驗。01操作人員應(yīng)熟悉儀器的操作和維護程序。02實驗室應(yīng)定期對操作人員進行技能評估和培訓(xùn)。03數(shù)據(jù)采集和處理應(yīng)遵循標(biāo)準(zhǔn)化的程序和方法。數(shù)據(jù)分析應(yīng)使用專業(yè)的軟件，并確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。實驗室應(yīng)建立數(shù)據(jù)管理和保存的制度，以便追溯和復(fù)查。5.5數(shù)據(jù)處理與分析0102035.6質(zhì)量控制與保證010203實驗室應(yīng)建立嚴(yán)格的質(zhì)量控制體系，包括定期的內(nèi)部和外部質(zhì)量評估。所有測定結(jié)果應(yīng)經(jīng)過審核和確認(rèn)，確保其準(zhǔn)確性和可靠性。實驗室應(yīng)參與行業(yè)內(nèi)的質(zhì)量改進活動，不斷提高測定水平和服務(wù)質(zhì)量。065.1試劑或材料熒光染料用于標(biāo)記和檢測細(xì)胞，如常用的FITC、PE、APC等。特異性抗體用于識別和結(jié)合目標(biāo)細(xì)胞，需選擇與待測細(xì)胞特異性結(jié)合的抗體。5.1.1熒光染料和抗體緩沖液用于調(diào)整樣本pH值，保持細(xì)胞活性，如PBS緩沖液。固定液用于固定細(xì)胞形態(tài)，防止細(xì)胞在后續(xù)處理中發(fā)生變化，如多聚甲醛。5.1.2緩沖液和固定液5.1.3其他試劑和材料用于去除紅細(xì)胞，避免對實驗結(jié)果產(chǎn)生干擾。溶血素用于封閉非特異性結(jié)合位點，減少非特異性染色。用于實驗過程中的樣本處理和操作。封閉液用于洗滌細(xì)胞，去除未結(jié)合的熒光染料和抗體。洗滌液01020403離心管、移液管等實驗器材075.2儀器設(shè)備數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)流式細(xì)胞儀應(yīng)具備強大的數(shù)據(jù)處理能力，能夠?qū)Σ杉降募?xì)胞信號進行快速、準(zhǔn)確的分析和處理。光學(xué)系統(tǒng)流式細(xì)胞儀應(yīng)具備高靈敏度的光學(xué)檢測系統(tǒng)，包括激光器和光電倍增管等，以確保對細(xì)胞標(biāo)記物的準(zhǔn)確檢測。流體系統(tǒng)流式細(xì)胞儀的流體系統(tǒng)應(yīng)能夠精確控制樣本和試劑的流速，保證細(xì)胞在檢測過程中的穩(wěn)定性和一致性。5.2.1流式細(xì)胞儀5.2.2配套設(shè)備試劑和耗材包括熒光染料、抗體、微球等，用于細(xì)胞標(biāo)記和檢測。樣本處理設(shè)備包括離心機、混勻器、移液器等，用于樣本的預(yù)處理和操作。儀器校準(zhǔn)定期對流式細(xì)胞儀進行校準(zhǔn)，確保儀器各項指標(biāo)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。質(zhì)控樣品5.2.3儀器校準(zhǔn)與質(zhì)控使用已知特性的質(zhì)控樣品對儀器進行測試，以評估儀器的性能和狀態(tài)。0102定期清潔儀器表面和內(nèi)部部件，保持儀器的清潔衛(wèi)生。日常清潔按照廠家推薦的維護計劃進行預(yù)防性維護，以延長儀器的使用壽命和確保性能穩(wěn)定。預(yù)防性維護5.2.4儀器維護與保養(yǎng)085.3樣本制備010203樣本應(yīng)來源于可靠的生物樣本庫或經(jīng)認(rèn)證的實驗室。選擇具有代表性的樣本，確保測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。避免使用受污染、變質(zhì)或損壞的樣本。5.3.1樣本來源與選擇5.3.2樣本處理與保存010203根據(jù)實驗需求，對樣本進行適當(dāng)?shù)奶幚恚珉x心、洗滌、固定等。樣本應(yīng)在適當(dāng)?shù)臈l件下保存，以確保細(xì)胞的活性和完整性。避免反復(fù)凍融，以免影響細(xì)胞活性。5.3.3樣本標(biāo)記與染色根據(jù)實驗需求，選擇合適的熒光染料對細(xì)胞進行標(biāo)記。01確保標(biāo)記過程中細(xì)胞的活性和完整性不受影響。02遵循染料的使用說明，確保標(biāo)記效果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。03根據(jù)實驗需求和儀器要求，調(diào)整樣本的濃度和體積。確保樣本在測定過程中能夠均勻流動，避免堵塞或漏檢。在調(diào)整濃度和體積時，應(yīng)注意保持細(xì)胞的活性和完整性。5.3.4樣本濃度與體積調(diào)整010203095.4試驗步驟收集待測細(xì)胞樣品，確保細(xì)胞數(shù)量足夠且活性良好。5.4.1樣品準(zhǔn)備對細(xì)胞進行必要的處理，如洗滌、離心等，以去除雜質(zhì)和死細(xì)胞。根據(jù)實驗需求，對細(xì)胞進行染色或標(biāo)記。5.4.2流式細(xì)胞儀設(shè)定對儀器進行校準(zhǔn)和質(zhì)控，確保實驗結(jié)果的可靠性。調(diào)整流式細(xì)胞儀的參數(shù)，如流速、電壓等，以確保細(xì)胞檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度。根據(jù)實驗需求和細(xì)胞類型，選擇合適的激發(fā)光和發(fā)射光濾光片。010203010203將處理好的細(xì)胞樣品加入流式細(xì)胞儀的進樣管中。啟動流式細(xì)胞儀，開始檢測細(xì)胞樣品。在檢測過程中，密切關(guān)注儀器狀態(tài)和細(xì)胞信號，確保實驗順利進行。5.4.3上機檢測5.4.4數(shù)據(jù)處理與分析收集并保存實驗數(shù)據(jù)，確保數(shù)據(jù)的完整性和準(zhǔn)確性。使用專業(yè)的數(shù)據(jù)分析軟件對流式細(xì)胞儀檢測的數(shù)據(jù)進行處理和分析。根據(jù)實驗需求，繪制相應(yīng)的圖表和曲線，以便更直觀地展示實驗結(jié)果。105.5數(shù)據(jù)分析在數(shù)據(jù)分析前，應(yīng)去除由于儀器噪聲、操作失誤等原因產(chǎn)生的異常數(shù)據(jù)，以確保分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。去除異常值數(shù)據(jù)歸一化數(shù)據(jù)篩選為了消除不同樣本之間的量綱差異，需要對數(shù)據(jù)進行歸一化處理，使得所有數(shù)據(jù)在相同的尺度上進行比較。根據(jù)實驗需求，篩選出符合特定條件的數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析。5.5.1數(shù)據(jù)預(yù)處理通過觀察數(shù)據(jù)的分布情況，判斷數(shù)據(jù)是否符合預(yù)期，以及是否存在偏態(tài)或異常分布。評估數(shù)據(jù)分布檢查數(shù)據(jù)中是否存在重復(fù)值，以避免重復(fù)計算或誤導(dǎo)分析結(jié)果。檢查數(shù)據(jù)重復(fù)性分析數(shù)據(jù)中是否存在缺失值，以及缺失值對分析結(jié)果可能產(chǎn)生的影響。評估數(shù)據(jù)缺失情況5.5.2數(shù)據(jù)質(zhì)量評估通過計算均值、標(biāo)準(zhǔn)差、中位數(shù)等統(tǒng)計量，對數(shù)據(jù)的基本特征進行描述。描述性統(tǒng)計分析利用相關(guān)系數(shù)等方法，分析不同指標(biāo)之間的相關(guān)性，以揭示它們之間的內(nèi)在聯(lián)系。相關(guān)性分析根據(jù)數(shù)據(jù)的相似性，將數(shù)據(jù)分為不同的類別或群組，以便更好地理解和解釋數(shù)據(jù)。聚類分析5.5.3數(shù)據(jù)分析方法結(jié)果可視化利用圖表等方式，將分析結(jié)果以直觀、易懂的形式呈現(xiàn)出來。結(jié)果解讀結(jié)合實驗背景和目的，對分析結(jié)果進行深入解讀，挖掘潛在的信息和規(guī)律。報告撰寫將數(shù)據(jù)分析的過程、方法和結(jié)果整理成報告，以供后續(xù)研究或決策參考。0302015.5.4結(jié)果解讀與報告115.6方法確認(rèn)確保測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性通過方法確認(rèn)，可以驗證所選用的流式細(xì)胞測定法是否適用于特定的細(xì)胞純度測定，從而保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。方法確認(rèn)的重要性滿足法規(guī)和監(jiān)管要求在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，細(xì)胞純度測定結(jié)果的準(zhǔn)確性對于確保產(chǎn)品質(zhì)量和安全至關(guān)重要。通過方法確認(rèn)，可以滿足相關(guān)法規(guī)和監(jiān)管要求，確保產(chǎn)品的合規(guī)性。優(yōu)化實驗條件和參數(shù)方法確認(rèn)過程中需要對實驗條件和參數(shù)進行優(yōu)化，以獲得最佳的測定效果。這有助于提高測定的靈敏度和特異性，減少誤差和偏差。確定方法確認(rèn)的目標(biāo)和范圍：明確需要確認(rèn)的測定方法、樣品類型、測定指標(biāo)等，以及確認(rèn)過程中需要考察的關(guān)鍵因素。01準(zhǔn)備實驗材料和設(shè)備：根據(jù)確認(rèn)目標(biāo)，準(zhǔn)備相應(yīng)的實驗材料和設(shè)備，包括流式細(xì)胞儀、試劑、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品等。02制定實驗方案：設(shè)計合理的實驗方案，包括實驗步驟、樣品處理、數(shù)據(jù)收集和分析方法等。確保實驗方案能夠全面評估測定方法的性能。03進行實驗并收集數(shù)據(jù)：按照實驗方案進行實驗，收集相關(guān)數(shù)據(jù)，包括測定結(jié)果、精密度、準(zhǔn)確度、特異性等指標(biāo)。04數(shù)據(jù)分析和評估：對收集到的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和評估，判斷測定方法是否滿足要求。如果發(fā)現(xiàn)問題，需要對實驗方案進行調(diào)整和優(yōu)化。05方法確認(rèn)的步驟方法確認(rèn)的性能指標(biāo)評估測定結(jié)果與真實值之間的接近程度，反映測定方法的準(zhǔn)確性。準(zhǔn)確度評估測定結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性，反映測定方法的可靠性。精密度評估測定方法對低濃度目標(biāo)細(xì)胞的檢測能力。高靈敏度的方法可以更早地發(fā)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞，提高檢測的及時性和準(zhǔn)確性。靈敏度評估測定方法對目標(biāo)細(xì)胞的識別能力，以及對非目標(biāo)細(xì)胞的排除能力。這有助于減少假陽性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。特異性02040103在方法確認(rèn)過程中，需要注意實驗安全，避免對人員和環(huán)境造成危害。同時，也要遵守相關(guān)法規(guī)和倫理要求，確保實驗的合法性和合規(guī)性。方法確認(rèn)的注意事項嚴(yán)格按照實驗方案進行操作，避免人為誤差和偏差。對實驗數(shù)據(jù)進行合理的統(tǒng)計分析和解釋，確保結(jié)果的客觀性和準(zhǔn)確性。010203125.7報告測定結(jié)果應(yīng)詳細(xì)列出流式細(xì)胞測定的結(jié)果，包括但不限于細(xì)胞純度、細(xì)胞類型及比例等信息。報告內(nèi)容要求測定條件報告中應(yīng)注明測定時的實驗條件，如儀器型號、使用的抗體、熒光染料及相關(guān)參數(shù)等。數(shù)據(jù)分析方法應(yīng)描述數(shù)據(jù)分析的具體方法，包括使用的軟件、算法和統(tǒng)計方法等。報告中的數(shù)據(jù)應(yīng)準(zhǔn)確無誤，避免誤導(dǎo)使用者。準(zhǔn)確性報告應(yīng)易于閱讀和理解，圖表清晰，文字簡潔明了?？?/p>