《植物組織培養(yǎng)》課件-項(xiàng)目四 無(wú)菌操作

植物組織培養(yǎng)項(xiàng)目四無(wú)菌操作任務(wù)1外植體選擇任務(wù)2外植體預(yù)處理任務(wù)3無(wú)菌接種技術(shù)【知識(shí)點(diǎn)】

掌握外植體選擇的原則【技能點(diǎn)】

會(huì)正確選擇外植體素質(zhì)要求：培養(yǎng)學(xué)生無(wú)菌意識(shí)、創(chuàng)新意識(shí)、團(tuán)隊(duì)合作意識(shí)和生態(tài)環(huán)保意識(shí)；具有任務(wù)執(zhí)行力，規(guī)范操作、注意安全；科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)、實(shí)事求是的工作態(tài)度。任務(wù)1外植體選擇細(xì)胞全能型全能性實(shí)現(xiàn)的差異：同一植株各個(gè)不同部位的組織、器官有差異生殖細(xì)胞>體細(xì)胞分生組織細(xì)胞>分化細(xì)胞一、培養(yǎng)材料的選擇1、再生能力強(qiáng)的健壯植株2、最佳時(shí)期3、優(yōu)良種質(zhì)，遺傳穩(wěn)定性好4、適宜部位，容易消毒5、大小適宜1、再生能力強(qiáng)的健壯植株外植體必須有良好的增殖能力，在培養(yǎng)中篩選增殖能力最強(qiáng)的材料。篩選不同基因型植物所需的特殊培養(yǎng)基。通常年幼組織比年老組織有較高的形態(tài)發(fā)生能力，容易培養(yǎng)，有較大的再生能力。植物上部器官的生長(zhǎng)時(shí)間短，但生理年齡較老。而越往基部則生理年齡越小。模塊三一般而言，分化程度高的細(xì)胞，其脫分化越難。因此，應(yīng)盡量選擇未分化或分化程度較輕的組織作為外植體材料。2、最佳時(shí)期三點(diǎn)因素：材料、時(shí)間和污染因素。取材料季節(jié)和時(shí)間，對(duì)離體培養(yǎng)至關(guān)重要。處于生長(zhǎng)季節(jié)，較幼嫩的外植體培養(yǎng)容易。2、最佳時(shí)期秋冬季取材需要處理。春季取材含菌數(shù)少，夏季、雨季、濕熱季節(jié)取材不容易滅菌成功。3、選擇優(yōu)良的種質(zhì)優(yōu)良的種質(zhì)是成功的第一步。選擇具有明確的種性特征，優(yōu)良單株、優(yōu)良無(wú)性系、新品種、良種材料作為取出植株。并觀察其遺傳穩(wěn)定性、花色、果型、長(zhǎng)勢(shì)等性狀表現(xiàn)。觀察其遺傳穩(wěn)定性、花色、果型、長(zhǎng)勢(shì)等性狀表現(xiàn)。觀察其遺傳穩(wěn)定性、花色、果型、長(zhǎng)勢(shì)等性狀表現(xiàn)。觀察其遺傳穩(wěn)定性、花色、果型、長(zhǎng)勢(shì)等性狀表現(xiàn)。觀察其遺傳穩(wěn)定性、花色、果型、長(zhǎng)勢(shì)等性狀表現(xiàn)。觀察其遺傳穩(wěn)定性、花色、果型、長(zhǎng)勢(shì)等性狀表現(xiàn)。4、適宜部位，容易消毒來(lái)源于幼年植物的外植體比源于成年樹(shù)的外植體容易培養(yǎng)。同株植物中，較低部位外植體要比上不的外植體容易啟動(dòng)，培養(yǎng)成功可能性大。植物體的各個(gè)部位，如莖尖、莖段、皮層及維管組織、髓細(xì)胞、表皮、塊莖的貯藏薄壁細(xì)胞、花瓣根葉子鱗莖、胚珠和花藥等。莖尖是較好的部位，生長(zhǎng)速度快，遺傳性穩(wěn)定，又能獲得無(wú)病毒苗的重要途徑。葉片能保證多數(shù)植物的組織培養(yǎng)不會(huì)引起不良變異。對(duì)于培養(yǎng)較困難的植物，可以通過(guò)子葉或下胚軸來(lái)建立起組織培養(yǎng)再生體系。5、大小適宜外植體的表面積、體積、細(xì)胞數(shù)量會(huì)影響培養(yǎng)效果。選擇0.5-1cm左右。太大易污染，太小不易啟動(dòng)或啟動(dòng)后僅產(chǎn)生愈傷組織。莖尖、胚、胚乳等培養(yǎng)，按器官或組織單位切離。二、外植體的種類帶芽的外植體：頂芽、腋芽、根莖連接處的萌孽等。適合植物的離體快繁。模塊三胚：自然狀態(tài)和試管中雌雄配子結(jié)合后形成的各個(gè)時(shí)期的胚。容易培養(yǎng)。分化的器官組織：嫩莖、嫩葉、形成層、根、花瓣、花萼、珠心、種子等。分化的器官組織可經(jīng)誘導(dǎo)過(guò)渡到脫分化狀態(tài)。有些器官直接形成不定芽或體細(xì)胞胚?；ǚ奂按婆渥芋w中的單倍體細(xì)胞：——染色體數(shù)目減半，經(jīng)秋水仙素加倍可產(chǎn)生多倍體。三、減少外植體帶菌的措施1、外植體預(yù)先培養(yǎng)——用莖尖作外植體時(shí)，可先在室內(nèi)或無(wú)菌條件下對(duì)枝條進(jìn)行預(yù)先培養(yǎng)。2、外植體取材時(shí)間——晴天比陰雨天好?！挛绫仍绯亢?。3、取樣組織選擇——深層（內(nèi)部的分生組織）比表面和淺層組織好。小結(jié)1.外植體選擇原則2.外植體種類3.減少外植體帶菌的措施【知識(shí)點(diǎn)】

掌握外植體處理的一般方法【技能點(diǎn)】

會(huì)正確處理外植體素質(zhì)要求：培養(yǎng)學(xué)生無(wú)菌意識(shí)、創(chuàng)新意識(shí)、團(tuán)隊(duì)合作意識(shí)和生態(tài)環(huán)保意識(shí)；具有任務(wù)執(zhí)行力，規(guī)范操作、注意安全；科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)、實(shí)事求是的工作態(tài)度。任務(wù)2外植體處理外植體處理分為預(yù)處理和表面消毒，它是組培是否成功的第一關(guān)鍵步驟。一、外植體的預(yù)處理

外植體在接種前先要滅菌，在滅菌前，又先要進(jìn)行預(yù)處理。植物材料一般采取的預(yù)處理方法是，先對(duì)植物組織進(jìn)行修整，去掉不需要的部分，將準(zhǔn)備使用的植物材料在流水中沖洗干凈。1.常用的外植體修整方法莖尖、莖段:剪除枝條上的葉片、葉柄及刺、卷須等附屬物，軟質(zhì)枝條用軟毛刷蘸肥皂水刷洗，硬質(zhì)枝條用刀刮除枝條表面的蠟質(zhì)、油質(zhì)、茸毛等，枝條剪成帶2-3個(gè)莖節(jié)的莖段。葉片:葉片帶油脂、蠟質(zhì)、茸毛等可用毛筆蘸肥皂水刷洗，較大葉片可剪成若干帶葉脈的葉塊。果實(shí)、種子、胚乳:直接沖洗消毒。對(duì)種皮較硬的種子可去除種皮、預(yù)先用低濃度的鹽酸浸泡或機(jī)械磨損。1）對(duì)采來(lái)的植物材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)男藜籼幚怼３ゲ恍枰牟糠?，將所需的部分切割至適當(dāng)大小。2.外植體預(yù)處理步驟2）用洗衣粉水（每100ml水1-2角匙洗衣粉）等浸洗植物材料約5min，用毛刷進(jìn)行刷洗一邊材料，再用自來(lái)水沖凈洗衣粉水。這是進(jìn)一步減少污染的處理。3）將清洗好的材料置于自來(lái)水下流水沖洗幾分鐘至幾小時(shí)，主要以植物材料的清潔程度而定。對(duì)于污染嚴(yán)重時(shí)特別有效。二、外植體表面消毒1、滅菌原因植物組織大部分取自于田間，材料含微生物，不能直接培養(yǎng)，必須表面滅菌，才能培養(yǎng)。2.外植體特征外植體材料來(lái)源于不同環(huán)境，帶菌程度不同，滅菌難易程度和滅菌效果有明顯差別。溫室試材較田間的材料容易。新生嫩芽比老枝捎的芽容易。春季抽出的新芽滅菌效果好，污染率低。3.常用消毒劑原理：使用化學(xué)藥品直接作用于微生物引起蛋白質(zhì)變性，將其殺死的方法。常用化學(xué)滅菌試劑：一定濃度的：84消毒液、雙氧水、漂白粉、次氯酸鈉、升汞、酒精、來(lái)蘇水、高錳酸鉀、抗生素等。84消毒液（稀釋2-10倍）：84消毒液是一種有效地殺菌劑，較常用。漂白粉（1-10%濾液）：漂白粉是一種有效的殺菌劑，但應(yīng)避光、干燥保存。雙氧水（3-10%）：過(guò)氧化氫液能分解產(chǎn)生具有殺菌作用的氧氣次氯酸鈉液（0.5-10%）：次氯酸鈉能分解產(chǎn)生具有殺菌作用的氯氣升汞（氯化汞，0.1-1%）：有劇毒，效果好，但難除去殘留汞，要多次沖洗。注意：滅菌劑對(duì)植物組織有損傷，應(yīng)正確選擇滅菌劑的濃度和處理時(shí)間。為了使殺菌劑潤(rùn)濕整個(gè)組織表面，還需加入潤(rùn)濕劑。常用的潤(rùn)濕劑有Tween-80,或Tween-20，或Triton-X,可加入數(shù)滴或用0.1%的濃度，會(huì)提高殺菌的效果。4.外植體表面消毒過(guò)程準(zhǔn)備無(wú)菌容器、無(wú)菌水、滅菌劑、待用培養(yǎng)基等。材料的表面滅菌，在超凈臺(tái)操作。把材料放到滅菌過(guò)的瓶中，在70%酒精中浸30s，無(wú)菌水沖洗。將材料轉(zhuǎn)移到一個(gè)新無(wú)菌瓶中，加入滅菌液。（加表面活性劑吐溫-80數(shù)滴，輕搖。）定時(shí)，滅菌溶液倒出。無(wú)菌水沖洗3-10次，沖洗完畢后，接種。5.外植體滅菌方法1）莖尖、莖段及葉片等滅菌先對(duì)植物組織進(jìn)行修剪，去掉不需要的部分，然后用自來(lái)水沖洗。對(duì)表面不光滑或長(zhǎng)有絨毛的材料，可用洗滌劑清洗，必要時(shí)用毛刷充分刷洗，硬質(zhì)材料可用刀刮。模塊三2）花藥滅菌將整個(gè)花蕾或幼穗用70%酒精浸泡數(shù)秒鐘，然后用無(wú)菌水沖洗2-3次，再在漂白粉中浸泡10min，最后用無(wú)菌水沖洗2-3次。3）根及地下部器官的滅菌先用自來(lái)水沖洗，軟毛刷刷洗，用刀切去損傷及污染嚴(yán)重部位，再用酒精漂洗后，置于0.1%升汞中浸5-10min或2%次氯酸鈉中浸10-15min，用無(wú)菌水沖洗3次。4）果實(shí)及種子滅菌先用自來(lái)水沖洗10-20min，再用酒精迅速漂洗一下。果實(shí)用2%次氯酸鈉浸10min，后用無(wú)菌水沖洗2-3次。種子則先用10%次氯酸鈉浸20-30min，難以滅菌的可用0.1%升汞消毒5-10min。對(duì)于種皮太硬的種子，也可預(yù)先去掉種皮，再用4%次氯酸鈉浸泡8-10min。外植體采集據(jù)樹(shù)種、季節(jié)、部分等采集。刷洗材料用軟毛刷、毛筆等在流水下刷洗，可沾少量洗衣粉刷洗。沖洗材料把材料切割到適當(dāng)大小，用流水沖洗幾秒鐘或至數(shù)小時(shí)，細(xì)小或易漂浮材料用紗布、塑料紗窗或銅絲網(wǎng)籠扎住。注意沖洗時(shí)間越短越好?？偨Y(jié)：外植體修整處理外植體表面消毒小結(jié)1.外植體選擇原則2.

外植體預(yù)處理步驟3.外植體表面消毒過(guò)程【知識(shí)點(diǎn)】

掌握無(wú)菌接種技術(shù)【技能點(diǎn)】

熟練使用超凈工作臺(tái)與接種器具，會(huì)進(jìn)行初代培養(yǎng)。素質(zhì)要求：培養(yǎng)學(xué)生無(wú)菌意識(shí)、創(chuàng)新意識(shí)、團(tuán)隊(duì)合作意識(shí)和生態(tài)環(huán)保意識(shí)；具有任務(wù)執(zhí)行力，規(guī)范操作、注意安全；科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)、實(shí)事求是的工作態(tài)度。任務(wù)3接種技術(shù)模塊三上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院ShanghaiVocationalCollegeofAgricultureForestry無(wú)菌培養(yǎng)體系的建立61供體植物材料的確定外植體的選擇外植體的滅菌外植體的培養(yǎng)外植體的接種一、定義植物材料表面滅菌后，切割或分離出器官、組織、細(xì)胞等，并將它們轉(zhuǎn)接到無(wú)菌的新培養(yǎng)基上的過(guò)程。（1）進(jìn)入緩沖間更換工作服，帶上口罩和帽子，換拖鞋，洗手等。二、接種前準(zhǔn)備工作（2）然后進(jìn)風(fēng)淋室，對(duì)工作人員進(jìn)行消毒滅菌。（有條件的情況下）進(jìn)入接種室打開(kāi)超凈工作臺(tái)、打開(kāi)超凈工作臺(tái)的紫外燈，檢查儀器表是否正常。（3）退出接種室后關(guān)門(mén)，并打開(kāi)接種室的紫外燈。（4）脫下工作服、口罩、帽子、拖鞋，退出緩沖間關(guān)門(mén)并打開(kāi)緩沖間紫外燈。（5）等待空間消毒滅菌15-20分鐘，期間準(zhǔn)備好所有外植體消毒的材料、工具和接種工具。（6）待空間消毒滅菌時(shí)間滿后，檢查紫外燈是否關(guān)閉。（7）按照步驟（1）、（2）進(jìn)入接種室。（8）調(diào)整座位高度，以達(dá)到舒適度為宜。（9）消毒工作臺(tái)，噴灑酒精于工作臺(tái)上下左右4面，勿噴出風(fēng)面。（10）取出酒精棉同一方向擦拭5個(gè)面，包括出風(fēng)口。（11）打開(kāi)酒精燈調(diào)整燈芯長(zhǎng)度為1.5cm。（12）將用酒精棉擦拭接種工具，后插入消毒器滅菌（300℃）。（13）其他用具材料帶入工作臺(tái)前先需噴灑酒精消毒，分別放置于工作臺(tái)面。（14）點(diǎn)燃酒精燈，消毒雙手后開(kāi)始接種操作。三、接種技術(shù)超凈工作臺(tái)面滅菌：70%酒精擦洗，并用紫外燈照射20min。接種物品的滅菌：接種服、帽子、口罩要常清洗、并用紫外線滅菌。雙手須用肥皂水洗干凈，進(jìn)行操作前再用70%酒精擦洗雙手。5）上工作臺(tái)后，用酒精棉球擦拭雙手及臺(tái)面等，包括指甲縫，最后擦拭工作臺(tái)。案例分析（1）根據(jù)需要取出無(wú)菌紙或接種盤(pán)1-2個(gè)放置燈焰區(qū)內(nèi)，一紙一瓶及時(shí)更換。（2）取出培養(yǎng)基打開(kāi)瓶蓋，蓋口向下放置臺(tái)面，瓶身與出風(fēng)面平行，瓶口不能對(duì)著出風(fēng)口或向上，應(yīng)平行或微向下。（3）用冷卻的接種工具接種材料。材料要均勻分布。（4）接完一瓶用酒精棉擦拭工具插入消毒器滅菌，待消毒時(shí)間已滿取出冷卻，以便循環(huán)使用。（一般準(zhǔn)備兩套接種工具）（5）接種完畢，清理工作臺(tái)面，關(guān)閉工作臺(tái)。同時(shí)做好標(biāo)識(shí)。案例分析注意事項(xiàng)：1）防止交叉污染。左右手不能相互交叉；每切割完1瓶母種材料就更換無(wú)菌濾紙；接種工具不能碰到臺(tái)面；接種工具要全面充分灼燒。2）在酒精燈火焰的有效范圍內(nèi)操作（直徑10cm）。3）接種人員注意個(gè)人衛(wèi)生，要經(jīng)常勤剪指甲，穿工作服、戴口罩與帽子，并嚴(yán)格滅菌。案例分析酒精棉球擦拭接種工具，將鑷子和剪子從頭至尾過(guò)火，尖端燒紅。最后用高溫消毒器。接種時(shí)，接種員雙手不能離開(kāi)工作臺(tái)，不能說(shuō)話等。接種完畢，清理工作臺(tái)。接種注意事項(xiàng)接種用具如刀、剪、鑷子每次使用前需滅菌處理，每用