《甘蔗葉片赤腐病抗性評價技術(shù)規(guī)程》草案

1T/CATEAXXXX—2024本文件確立了甘蔗葉片赤腐病抗病性評價技術(shù)規(guī)程，規(guī)定了術(shù)語和定義、評價程序、接種體制備、接種、病情調(diào)查及抗病性評價的要求。本文件適用于甘蔗種質(zhì)材料和甘蔗品種（系）對葉片赤腐病的抗性評價。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。T/CSTC02-2023甘蔗梢腐病抗性評價技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1甘蔗葉片赤腐病sugarcaneleafredrotdisease由鐮孢炭疽菌（ColletotrichumfalcatumWent）引起的發(fā)生在甘蔗葉片上的真菌病害。4評價程序甘蔗葉片赤腐病評價流程包括6個步驟，評價流程圖見圖1。圖1甘蔗葉片赤腐病抗性評價流程2T/CATEAXXXX—20245接種體制備5.1病原菌分離評價用真菌分離培養(yǎng)的方法從葉片赤腐病病葉上的病原物，并用病原物的特異引物ITS1/ITS4進行PCR分子評價。葉片赤腐病病原菌的詳細信息見附錄A。5.2病原菌的保存用50%甘油懸浮，于-80℃超低溫冰箱進行長期保存。5.3病原菌接種體制備將保存的菌株活化至PDA培養(yǎng)基平皿上，置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5d，用5mm打孔器制成菌餅用于接種。6接種6.1田間自然接種6.1.1田間鑒定圃田間鑒定圃設(shè)置參照T/CSTC02-2023的要求執(zhí)行。6.1.2田間試驗設(shè)計每個材料挑選蔗芽飽滿、一致的種芽300個于春季種植在鑒定圃中。試驗采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，單行區(qū)，行長8m~10m、行距1.2m，3次重復(fù)，每個小區(qū)種植100個芽，試驗區(qū)四周設(shè)置保護行。試驗材料包括高感和高抗對照種，標準對照品種見附錄B。6.2人工接種6.2.1室內(nèi)苗期接種溫室環(huán)境溫度保持在27℃~33℃,濕度保持在75%~88%。采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，設(shè)置3個重復(fù)，每個材料每個重復(fù)30株苗，將待評價材料種植于桶內(nèi)，每個桶內(nèi)保留3株苗，試驗材料包括高感和高抗標準對照品種，詳見附錄B。待甘蔗材料長到4葉~5葉期時，使用無菌注射器在甘蔗葉片中部中脈造成微創(chuàng)傷口，將菌餅貼在創(chuàng)傷處，用保鮮膜包裹，用PDA無菌菌餅作陰性對照。6.2.2離體葉段接種拔節(jié)初期選取長勢一致的待評價甘蔗材料+1葉30片，設(shè)置3個重復(fù)，包括高感和高抗標準對照品種，詳見附錄B。剪取8cm~10cm整齊對稱無裂痕葉段，使用無菌注射器在甘蔗葉片中部中脈造成微創(chuàng)傷口，將菌餅貼在創(chuàng)傷處，置于含有三層消毒濕潤濾紙的方盤中，每個品種每個重復(fù)接種葉片放置于同一個方盤，保證相同的濕度條件，用保鮮膜將方盤密封，置于25℃~30℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光周期為12h光照/12h黑暗，用PDA無菌菌餅作陰性對照。7病情調(diào)查7.1調(diào)查時間3T/CATEAXXXX—20247.1.1田間自然接種在甘蔗伸長盛期7月、8月、9月，每月調(diào)查一次。7.1.2室內(nèi)苗期在接種后7d~10d觀察到葉片赤腐病癥狀，每隔24h記錄發(fā)病情況，持續(xù)觀察30d直至病情穩(wěn)定。7.1.3離體葉段在接種后24h觀察到葉片赤腐病癥狀，每隔24h記錄發(fā)病情況，持續(xù)觀察7d直至病情穩(wěn)定。7.2分級標準甘蔗葉片赤腐病評價分級標準見附錄C。7.3記載方法田間自然接種和室內(nèi)苗期抗性評價記載方式為分別記錄每個重復(fù)的總株數(shù)，用目測法統(tǒng)計甘蔗葉片的發(fā)病株數(shù)及每一株的病害級別，調(diào)查并記載病害級別。甘蔗葉片赤腐病田間自然接種和室內(nèi)苗期抗性評價調(diào)查記載匯總表見附錄D表D.1。離體葉段抗性評價記載方式為通過觀察和測量病斑的長度，統(tǒng)計記錄甘蔗葉段的病害級別。甘蔗葉片赤腐病離體葉段抗性評價調(diào)查記載匯總表見附錄D表D.2。8抗病性評價8.1病情指標計算根據(jù)病情癥狀描述，計算發(fā)病率（IC）。發(fā)病率按式（1）計算×100....................................................................根據(jù)病情癥狀描述，計算病情指數(shù)（DI）。病情指數(shù)按式（2）計算。×100..............................................................式中：IC——為發(fā)病率；DI——為病情指數(shù)；S——為最高病級值；M——為發(fā)病總株數(shù)；N——為調(diào)查總株數(shù)；n——為各級病株數(shù)；s——為發(fā)病等級值。8.2抗性評價標準8.2.1田間自然接種抗性評價標準依據(jù)評價材料的最高病情指數(shù)確定抗性水平，劃分標準見附錄E表E.1。4T/CATEAXXXX—20248.2.2室內(nèi)苗期抗性評價標準依據(jù)評價材料的最高病情指數(shù)確定抗性水平，劃分標準見附錄E表E.2。8.2.3離體葉段抗性評價標準依據(jù)評價材料微創(chuàng)傷口接種處的病害擴展程度確定抗性水平，劃分標準見附錄E表E.3。8.3有效性判別感病對照品種或任一評價材料的抗性類別達到感病或以上時，該批次評價有效。8.4重復(fù)評價初次評價中表現(xiàn)為中抗和感病的材料，用相同的病原菌進行重復(fù)評價，不同批次間評價結(jié)果不一致時，宜以最低抗性類別為準。8.5抗病性評價報告宜以單個品種單獨出具，如集中批量送樣，也可多個品種出一份報告。評價結(jié)果報告單見附錄D表D.3，原始記錄應(yīng)保存完好備查。5T/CATEAXXXX—2024（資料性）甘蔗葉片赤腐病病原菌的生物學(xué)特性及分離鑒定和保存方法A.1生物學(xué)特性甘蔗葉片赤腐病病原菌為鐮孢炭疽菌（Colletotrichumfalcatumwent將葉片分離到的病原菌侵染蔗莖，發(fā)現(xiàn)該病原菌未對蔗莖造成侵染，同時在廣西田間赤腐病主要以葉片赤腐病形式存在，莖赤腐病發(fā)生較少，有研究表明葉片赤腐病分離到的病原菌不會對蔗莖造成傷害，與本研究結(jié)果一致。篩選到強致病菌株CF5，菌落呈圓形，菌絲體白色或灰色，分生孢子半月形，平均25μm×6μm，單孢，色淺，無隔膜，內(nèi)含粒狀物及優(yōu)點，常具一個中央大液泡，分生孢子密集時呈粉紅色或橙紅色，分生孢子長55μm~65μm，分生孢子梗長圓形，淡色，無隔膜，著生于分生孢子盤中，在分生孢子梗中雜有剛毛。除分生孢子外，此菌還常產(chǎn)生能抵抗干旱和不良環(huán)境的厚垣孢子，呈墨綠色，圓形或橢圓形，含油點，多生在菌絲的頂端，脫落后即發(fā)芽入侵寄主（圖A.1）。圖A.1甘蔗葉片赤腐病菌的菌落和分生孢子形態(tài)A.2病原菌分離、保存與鑒定A.2.1分離A.2.1.1分離病原菌取病健交界處（病斑與健康部分的交界處）的甘蔗葉片，剪成邊長為0.3cm~1.5cm大小的長方形葉片，在超凈工作臺中，將葉片置于0.1%升汞中滅菌30s，而后在70%的酒精溶液中浸泡30s，最后用ddH2O清洗三遍，置于滅菌濾紙上自然晾干。用鑷子將3片~5片葉片置于含100μg/mL氨芐青霉素的PDA培養(yǎng)基上，28℃倒置暗培養(yǎng)3d~4d。A.2.1.2培養(yǎng)純化6T/CATEAXXXX—2024待菌落長出后，挑取不同形態(tài)的菌落進行劃線純化培養(yǎng)，28oC倒置培養(yǎng)2d~3d后，純化3~4代，直到菌株為純合。A.2.1.3真菌微生物的制備在無菌操作的條件下，取二代純化后的培養(yǎng)平板，使用滅菌的無菌槍頭挑取單個菌落邊緣的真菌置于PDW液體培養(yǎng)基中，于28oC搖床200rpm震蕩培養(yǎng)5d。A.2.2菌株保存及病原菌DNA提取無菌操作條件下，吸取菌液400μL于2mL離心管中，加入等體積的50%甘油混勻，用封口膜密封，置于-80oC保存菌株?；蚪MDNA使用真菌基因組試劑盒提取。A.2.3鑒定A.2.3.1病原菌分子鑒定利用特異引物ITS1/ITS4進行PCR評價（ITS15’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS45’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR反應(yīng)體系總體積為25μL，內(nèi)含2×Taqmix12.5μL，引物（10μmol/L）各1.0μL，40ng模板DNA1μL，ddH2O9.5μL。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用Bio-Rad公司凝膠成像系統(tǒng)照相，400bp處觀察到單一條帶，PCR產(chǎn)物純化后進行測序、比對（序列GenBank登錄號：PP217426）。A.2.3.2致病性測定依據(jù)人工接種高感材料的病情指數(shù)確定菌株致病力，當(dāng)病情指數(shù)達到25以上，表明菌株致病力強?？共⌒栽u價應(yīng)選取強致病力的菌株進行。取純化后目標菌株的培養(yǎng)平板，無菌條件下挑取單菌落邊緣菌絲接種于PDA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5d，即菌株處于生命力極旺盛的指數(shù)生長期時，用5mm打孔器制成菌餅用于接種。使用無菌注射器在甘蔗葉片中部中脈造成微創(chuàng)傷口，將菌餅貼在創(chuàng)傷處，用保鮮膜進行包裹，用PDA無菌菌餅作陰性對照。接種于易感品種中蔗9號，7d時開始記錄發(fā)病情況，此后每24h調(diào)查一次，持續(xù)觀察30d，直至病情穩(wěn)定。7T/CATEAXXXX—2024標準對照品種B.1標準對照品種在同一試驗環(huán)境下，待測材料的抗性要參照已知抗性的標準對照品種見表B.1。表B.1甘蔗葉片赤腐病抗性對照品種抗性類別對照品種高抗（HR）新臺糖22號、新臺糖16號抗?。≧）云蔗99-596、桂糖03-351中抗（MR）CP88-1762、桂糖21號感?。⊿）中蔗1號、福農(nóng)04-3504高感（HS）中蔗9號、中蔗6號8T/CATEAXXXX—2024甘蔗葉片赤腐病分級標準C.1甘蔗葉片赤腐病分級標準甘蔗葉片赤腐病分級標準，以每株中發(fā)病最嚴重的葉片為準，田間自然接種和室內(nèi)苗期劃分標準圖見圖C.1，對應(yīng)癥狀描述見表C.1。圖C.1甘蔗葉片赤腐病田間自然接種和室內(nèi)苗期分級標準圖表C.1甘蔗葉片赤腐病田間自然接種和室內(nèi)苗期病害級別病害級別癥狀描述0無癥狀1葉片中脈出現(xiàn)少許紅色小點或病斑2葉片中脈紅色病斑蔓延至全葉五分之一3葉片中脈病斑蔓延至全葉五分之三，呈紅褐色，中脈附近葉片褪綠黃化4整片葉中脈均為深紅褐色病斑，部分葉片出現(xiàn)折斷、下垂9T/CATEAXXXX—2024離體葉段劃分標準圖見圖C.2，對應(yīng)癥狀描述見表C.2。圖C.2甘蔗葉片赤腐病離體葉段分級標準圖表C.2甘蔗葉片赤腐病離體葉段病害級別病害級別癥狀描述0接種點出現(xiàn)輕微紅色病斑≤1.00cm1葉片中脈紅褐色病斑蔓延1.01cm~3.00cm2葉片中脈紅褐色病斑蔓延3.01cm~5.00cm，葉片出現(xiàn)輕微褪綠黃化3葉片中脈紅褐色病斑蔓延5.01cm~8.00cm，葉片褪綠面積增大4整個葉片中脈幾乎均為深紅褐色病斑，葉片嚴重褪綠，出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象T/CATEAXXXX—2024調(diào)查記載匯總表和結(jié)果報告單D.1甘蔗葉片赤腐病田間自然接種和室內(nèi)苗期抗性評價調(diào)查記載匯總表見表D.1。表D.1甘蔗葉片赤腐病田間自然接種和室內(nèi)苗期抗性評價調(diào)查記載匯總表鑒定方法調(diào)查株數(shù)各級病情株數(shù)病情指數(shù)抗病性水平備注2級4級評價人員：復(fù)核人員：日期：注：在開展評價調(diào)查時，評價人員與復(fù)核人員一同進行，評價人員對評價植株病害級別進行判斷，經(jīng)復(fù)核人員確定后記載。D.2甘蔗葉片赤腐病離體葉段評價調(diào)查記載匯總表見表D.2。表D.2甘蔗葉片赤腐病離體葉段抗性評價調(diào)查記載匯總表離體葉片數(shù)量各級葉片數(shù)量抗病性水平備注2級4級評價人員：復(fù)核人員：日期：注：在開展評價調(diào)查時，評價人員與復(fù)核人員一同進行，評價人員對評價植株病害級別進行判斷，經(jīng)復(fù)核人員確定后記載。T/CATEAXXXX—2024D.3甘蔗品種（系）葉片赤腐病抗性評價結(jié)果報告單見表D.3。表D.3甘蔗品種（系）葉片赤腐病抗性評價結(jié)果報告單品種編號品種名稱委托評價單位評價編號樣品接收時間樣品數(shù)量評價項目評價依據(jù)評價結(jié)果評價地點評價依據(jù)評價方法非自然接種的接種體組成種植日期接種日期調(diào)查日期病情指數(shù)/病斑長度抗病性水平結(jié)論備注制表人：審核人：批準人：日期：注：評價結(jié)果報告應(yīng)蓋評價單位公章，應(yīng)有制表人、審核人和批準人簽字。T/CATEAXXXX—2024抗性評價標準E.1田間自然接種抗性評價標準見表E.1。表E.1田間自然接種抗性評價標準抗性級別發(fā)病率(IC)病情指數(shù)(DI)抗性類別00<IC≤20%0<DI≤10高抗（HR）120<IC≤35%10<DI≤20抗病（R）235<IC≤50%20<DI≤35中抗（MR）350<IC≤70%35<DI≤50感?。⊿）4高感（HS）E.2室內(nèi)苗期抗性評價標準見表E.2。表E.2室內(nèi)苗期抗性評價標準抗性級別病情指數(shù)(DI)抗性類別00<DI≤5高抗（HR）15<DI≤10抗?。≧）210<DI≤15中抗（MR）315<DI≤25感病（S）4高感（HS）注：苗期接種發(fā)病率100%，以病情指數(shù)進行抗性評價。E.3離體葉段抗性評價標準見表E.3。表E.3離體葉段抗性評價標準抗性級別癥狀描述（病斑長度）抗性類別0接種點出現(xiàn)輕微紅色病斑≤1.00cm高抗（HR）1紅褐色病斑蔓延（病斑暈圈沿中脈方向長度1.01cm~3.00cm）抗?。≧）2紅褐色病斑蔓延，葉片出現(xiàn)輕微褪綠黃化（病斑暈圈沿中脈方向長度3.01cm~5.00cm）中抗（MR）3紅褐色病斑蔓延，葉片褪綠面積增大（病斑暈圈沿中脈方向長度5.01cm~8.00cm）感?。⊿）4整個葉片中脈幾乎均為深紅褐色病斑，葉片嚴重褪綠，出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象（病斑暈圈沿中脈方向長度>8.01cm）高感（HS）T/CATEAXXXX—2024參考文獻[1]《中華人民共和國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法》2022年修訂.[2]AbbottE.PhysiologicformsofColletotrichumfalcatumWent.Phytopathology,1933,23,557-559.[3]李婕,張榮躍,王曉燕,