植物激素的測定方法專家講座

植物激素的測定方法專家講座第1頁植物激素的測定方法專家講座第2頁DNM-9602G酶標分析儀DNM-9602標配酶標分析儀

DNM-9602A酶標分析儀幾個酶標分析儀植物激素的測定方法專家講座第3頁操作步驟包被---溫育---洗滌---競爭---溫育---洗滌---加二抗---溫育---洗滌---顯色---比色---計算植物激素的測定方法專家講座第4頁包被每小孔中加入100μl包被緩沖液，然后將酶標板放入內(nèi)鋪濕紗布帶蓋瓷盤內(nèi)。37℃下1.5小時。植物激素的測定方法專家講座第5頁洗板將反應(yīng)液甩干并在報紙上拍凈。第一次加入洗滌液后要馬上甩掉。然后再接著加第2次。共洗滌3次。植物激素的測定方法專家講座第6頁競爭即加標準物、待測樣和抗體。加標樣及待測樣：取適量所給標樣稀釋配成：ABA標準曲線最大濃度為100ng/ml,然后再依次2倍稀釋8個濃度（包含2個0ng/ml，加入前兩行最終兩排）。將系列標準樣加入96孔酶標板1、2、3行，每個濃度加3孔，每孔50μl,其余孔加待測樣，每個樣品重復(fù)3孔，每孔50μl。植物激素的測定方法專家講座第7頁加抗體在微孔中加入一定量抗體,混勻后每孔加50μl，然后將酶標板加入濕盒內(nèi)開始競爭。競爭條件37℃左右0.5h。植物激素的測定方法專家講座第8頁洗板將反應(yīng)液甩干并在報紙上拍凈。第一次加入洗滌液后要馬上甩掉。然后再接著加第2次。共洗滌3次。植物激素的測定方法專家講座第9頁加“二抗”將適當酶標二抗，加入10ml樣品稀釋液中（比如稀釋倍數(shù)1:1000就加10μl），混勻后，在酶標板每孔加100μl，然后將其放入濕盒內(nèi)，置37℃下，溫育0.5h。植物激素的測定方法專家講座第10頁洗板將反應(yīng)液甩干并在報紙上拍凈。第一次加入洗滌液后要馬上甩掉。然后再接著加第2次。共洗滌3次。植物激素的測定方法專家講座第11頁加底物顯色在每孔中加100μl鄰苯二胺（OPD）溶液（小心勿用手接觸OPD），（每10ml溶液中含4μl30%H202?；靹?，然后放入濕盒內(nèi)，當顯色適當后（肉眼能看出標準曲線有顏色梯度，且100ng/ml孔顏色還較淺），每孔加入50μl2mol/L硫酸終止反應(yīng)。植物激素的測定方法專家講座第12頁比色在酶聯(lián)免疫分光光度計上依次測定標準物各濃度和各樣品490nm處OD值。植物激素的測定方法專家講座第13頁用酶標儀進行比色，以0ng/ml標準孔為空白孔，在波長450nm處罰別讀取各標準孔和樣本孔OD值，以O(shè)D值為橫坐標，“標樣激素含量對數(shù)”為縱坐標，在半對數(shù)坐標紙上畫出標準曲線，以測定孔OD值在標準曲線上查出待測樣品ABA含量對數(shù)。利用反對數(shù)求得ABA絕對含量。數(shù)據(jù)分析植物激素的測定方法專家講座第14頁植物激素測定方法？生物活性法氣相色譜（氣-質(zhì)聯(lián)機）液相色譜（液-質(zhì)聯(lián)機）酶連免疫法（ELISA法）植物激素的測定方法專家講座第15頁植物激素的測定方法專家講座第16頁植物激素的測定方法專家講座第17頁問題：我們該選擇哪種板呢？植物激素的測定方法專家講座第18頁ELISA技術(shù)特點與不足

（1）ELISA特點：在固相表面組裝免疫活性物質(zhì)形成"免疫吸附劑"；酶標識免疫活性物質(zhì)，進行信號放大；有二步溫育反應(yīng)二次洗滌過程；靈敏度特異性相對較高。（2）ELISA不足：只能檢測到ng水平，精密度差（批內(nèi)CV15-20%）；線性范圍窄（一個數(shù)量級）。植物激素的測定方法專家講座第19頁注意事項：（1）微量加液器應(yīng)注意保養(yǎng)并定時校正，不然結(jié)果誤差較大，同時加樣時不可出現(xiàn)氣泡，以免反應(yīng)物間不能充分混勻反應(yīng)。（2）洗滌時力爭次數(shù)足夠，且防止形成氣泡，不然洗滌不完全。（3）溫育時要力爭受熱均勻，同時防止液體蒸發(fā)。（4）比色時反應(yīng)管內(nèi)不能留有氣泡，管底不能存有水滴，不然出現(xiàn)較大誤差。植物激素的測定方法專家講座第20頁酶聯(lián)免疫吸附試驗

(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)原理（以間接性ELISA為例）：顯色植物激素的測定方法專家講座第21頁抗原植物激素的測定方法專家講座第22頁醫(yī)學上主要抗原傷寒桿菌鏈球菌痢疾桿菌流感病毒口蹄疫病毒狂犬病病毒植物激素的測定方法專家講座第23頁抗原概述抗原（Ag）是指能與淋巴細胞抗原受體特異性結(jié)合，刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，并能與對應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物在體內(nèi)、外發(fā)生特異性反應(yīng)物質(zhì)抗原兩個基本特征免疫原性（immunogenicity)免疫反應(yīng)性(immunoreactivity)植物激素的測定方法專家講座第24頁完全抗原(completeantigen)半抗原(hapten)載體(carrier)半抗原

+載體抗體BT完全抗原BBBT植物激素的測定方法專家講座第25頁抗體（Ab）植物激素的測定方法專家講座第26頁抗體（antibody,Ab)是B細胞識別抗原后增殖分化為槳細胞所產(chǎn)生一個蛋白質(zhì)，主要存在于血清等體液中，能與對應(yīng)抗原特異性地結(jié)合，含有免疫功效。免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）是指含有抗體活性或化學結(jié)構(gòu)與抗體相同球蛋白一、基本概念：植物激素的測定方法專家講座第27頁二、免疫球蛋白分子結(jié)構(gòu)植物激素的測定方法專家講座第28頁免疫球蛋白基本結(jié)構(gòu)四肽鏈結(jié)構(gòu)

，鏈間二硫鍵連接兩條重鏈（H）和兩條輕鏈（L）氨基端和羧基端。

植物激素的測定方法專家講座第29頁依據(jù)氨基酸排列次序不一樣分為：可變區(qū)（V）和恒定區(qū)（C）可變區(qū)（V區(qū)）：氨基酸組成、排列次序改變較大恒定區(qū)（C區(qū)）：氨基酸數(shù)量、種類、排列次序及含糖量都比較穩(wěn)定可變區(qū)與恒定區(qū)植物激素的測定方法專家講座第30頁植物激素的測定方法專家講座第31頁植物激素的測定方法專家講座第32頁

單克隆和多克隆抗體比較和用途特異性敏感性均一性McAbPcAb低差無高強有1、用于免疫學檢測，輔助臨床診療2、McAb用于親和層析，分離微量可溶性抗原3、標識McAb用于基礎(chǔ)研究，了解細胞分化等4、制備生物導彈用于腫瘤、移植等臨床治療。植物激素的測定方法專家講座第33頁植物激素的測定方法專家講座第34頁植物激素的測定方法專家講座第35頁多克隆抗體：多個抗原決定基——機體——各種抗體混合物單克隆抗體（monoclonalantibody,mAb）：由一個B細胞克隆產(chǎn)生、針對某一特定抗原決定簇高度特異性抗體基因工程抗體六、人工制備抗體植物激素的測定方法專家講座第36頁植物激素的測定方法專家講座第37頁植物激素的測定方法專家講座第38頁用標識物標識抗體或抗原進行抗原抗體反應(yīng)借以提升免疫學診療敏感性熒光素：異硫氰酸熒光素（黃綠色熒光）、藻紅蛋白、羅丹明（紅色熒光）放射性同位素：125I、131I酶：辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶免疫熒光檢測法（IFA）放射免疫檢測法（RIA）酶免疫檢測法（EIA）液相（ELISA）、