植物病毒醫(yī)學宣教專家講座

葉蟬水稻普通矮縮病Ricedwarf

小麥黃矮病Wheatyellowdwarf植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第1頁水稻黃萎病植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第2頁玉米黑條矮縮病灰稻虱植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第3頁番茄病毒?。ň砣~）

豇豆病毒病西瓜病毒病馬鈴薯病毒病白菜病毒病植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第4頁植物病毒

經濟作用：綠菊花、郁金香、日本衛(wèi)矛

增產—菊芋潛病毒萵苣巨脈病毒櫻屬環(huán)斑病毒植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第5頁植物病毒

植物病毒特殊性：亞顯微性——病毒粒子微小隱蔽性——普通無肉眼可見病癥潛伏性——有隱癥現(xiàn)象微量性——病株體內病毒濃度低，且分布不均植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第6頁第八章植物病毒一、植物病毒病癥狀二、植物病毒生態(tài)學三、植物病毒傳輸四、植物抗病毒防衛(wèi)反應原理五、植物病毒病防治六、植物抗病毒基因工程

七、植物病毒檢測八、植物病毒純化、提純與保藏

本章關鍵點植物病毒病癥狀及其特點植物病毒傳輸病害防治原理與方法植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第7頁一、植物病毒病癥狀癥狀有診療價值，區(qū)分生理性病害、遺傳病害、病毒病害病毒性病害（1）田間發(fā)病普通分散，少數(shù)土傳可小片發(fā)生，但極少普遍發(fā)生—與昆蟲介體、接觸傳輸相關（2）可傳染性，借助介體或其它傳染方式傳輸植物病毒病研究中，普通進行生物學測定、傳染試驗，再做電鏡觀察植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第8頁植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第9頁一、植物病毒病癥狀

1、宏觀癥狀macroscopicsymptom生長減縮(Reductionofgrowth)變色discoloration：葉、花、莖、果實及種子壞死necrosis畸形生長malformation失水2、微觀癥狀microscopicsymptom類型：癥狀symptom與病象syndrome(各種癥狀總稱）植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第10頁一、植物病毒病癥狀

1、宏觀癥狀macroscopicsymptom

(1)

生長減縮(Reductionofgrowth)

：矮縮dwarfing、矮化stunting、小實smallfruit、小葉littleleaf、縮根rootreduction大蒜病毒病矮化Stunting矮縮Dwarfing植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第11頁一、植物病毒病癥狀

1、宏觀癥狀macroscopicsymptom(2)變色discoloration

葉變色—

褪綠chlorosis、白化blanching、紫/紅/黃化purpling/reddening/yellowing、褐/黑/古銅化browning/blackening/bronzing

脈明癥vein-clearing、雜色variegation、花葉mosaic、

斑駁mottling、斑點spoting/doting、線紋linepattern、環(huán)紋ringstripe、條紋stripe、環(huán)斑ringspot、條斑streak

沿脈變色vein-blanding、脈間花葉interveinalmosaic葉綠素、胡蘿卜素、花青素（紅到紫）植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第12頁TobamovirusMosaicsymptomsontobaccocausedbyTMV斑駁Mottle植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第13頁TMVtransmissionbyanApissp.Aseveremosaicsymptomontomatoleaf(TMV)腿色斑Chloroticspoting黃化Yellowing植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第14頁斑駁Mottle脈明癥Vein-clearing條斑Leafstreak植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第15頁腿色斑駁Chloroticmottleviroidyellowdwarf變色seedcoatmottling植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第16頁郁金香碎錦花葉病

花變色—碎色癥colorbreaking、花瓣變綠virescence雜色花郁金香、香石竹、紫羅蘭、虞美人、唐菖蒲植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第17頁(3)

壞死necrosis

枯斑necroticspot、線條壞死streaknecrosis、死頂topnecrosis、蝕紋etch(不規(guī)則線紋)一、植物病毒病癥狀

辣椒病毒病馬鈴薯病毒病植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第18頁necrosissymptomsontomatocausedbyTMVLocallesionsintobaccooneweekafterinoculationwithTMV

植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第19頁一、植物病毒病癥狀

(4)畸形生長malformation：耳突enation潰瘍性腫瘤cankerous腫枝shootswelling扁枝癥branchflattening蕨葉癥fernleaf線葉癥leafnarrowing皺縮crinkling曲葉leafcurl花束癥bogue’t束頂癥bunchytop葉片偏上性epinasty卷葉leafrolling叢枝癥witch’sbroom拐節(jié)癥zigzaggrowth花器變態(tài)antholysis綠花virescence變葉phyllody縮節(jié)apostasis不孕性sterility植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第20頁卷葉Leafrolling芹菜耳突Enation畸形植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第21頁脈明癥vein-clearing莖瘤畸形Healthy(left)andnaturallymop-topaffected(right)plantsofpotato植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第22頁蕨葉癥fernleaf西葫蘆皰斑畸形畸形植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第23頁

叢枝癥拐節(jié)癥witch’sbroomzigzaggrowth畸形Peach

leafdistortion植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第24頁畸形植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第25頁萎蔫wilting(5)失水：萎蔫wilting

過量蒸騰overtranspiration

病毒本身阻塞導管、膠質、形成侵填體堵塞導管一、植物病毒病癥狀

植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第26頁2、微觀癥狀microscopicsymptom組織病變：callose、侵填體tylose、流膠gummosis

正常組織增生hyperplasia增大hypertrophy

可染色檢驗抑制木質素形成(inhibitionofligninformation)內含體inclusion:柱狀、風輪狀pinwheel、卷筒狀scroll、晶狀等局部癥狀localsymptom系統(tǒng)癥狀systemicsymptom植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第27頁外表癥狀隱潛masking

：無癥侵染symptomlessinfection高溫隱潛hightemperaturemasking取得免疫acquiredimmunityhypersensitiveresponseHR砧木作用Stockeffect一、植物病毒病癥狀

植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第28頁二、植物病毒生態(tài)學Viruspathoecosystem植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第29頁二、植物病毒生態(tài)學(一)、生物原因1、病毒及其寄主植物

栽培植物種及品種改變野生植物及雜草是病毒貯源2、傳輸介體與病毒擴展3、人和動物傳輸4、栽培辦法與病毒病關系植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第30頁生態(tài)系統(tǒng)中，各種原因相互制約，維系著平衡狀態(tài)，不要隨意打破。澳大利亞包心萵苣壞死黃化病毒，其毒源植物是野生苦苣菜(sonchus)野兔多，引進粘液瘤病毒控制野兔苦苣菜過多——包心萵苣壞死黃化病毒毒源多萵苣病毒病大發(fā)生二、植物病毒生態(tài)學植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第31頁(二)、環(huán)境原因土壤情況：N、P、K含量與百分比、土壤溫度、濕度、土壤類型氣象原因：降雨、氣溫、風等影響氣傳和土傳病毒介體繁殖、傳輸速度等

二、植物病毒生態(tài)學植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第32頁三、植物病毒傳輸transmission(betweenplants)植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第33頁三、植物病毒傳輸植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第34頁三、植物病毒傳輸非介體傳輸：植物病毒從寄主體上，因為傷殘或分泌而到達體外，與另一寄主體經過微傷口接觸而傳染，或經過寄主細胞間有機結合而傳染。介體傳輸：病毒依附在其它生物體上，借其它生物體活動而進行傳輸、感染。植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第35頁（一）、非介體傳輸1、機械或汁液擦傷傳染2、種子傳染(1/10)3、無性繁殖材料4、土壤傳輸5、菟絲子(Cuscuta)傳染6、嫁接傳染植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第36頁（一）、非介體傳輸2、種子傳染(1/10)病毒在種子中分布：（1）病毒不能進入胚，在胚外，種子污染；（2）病毒可進入胚，但進入后是否被寄主消滅決定是否種傳病毒能否進入胚受病毒基因控制病毒種傳機理：（1）由帶毒母體直接侵入種胚（2）間接從生長點、莖尖侵入胚（3）經過異花授粉使帶毒花粉從外部經柱頭侵入健株胚在胚外outsidetheembryo,傳輸率低：種子成熟經過脫水、收獲、貯藏；有些接觸不到幼苗；有些存在于胚乳內。在胚內withintheembryo：真正意義上種傳植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第37頁（一）、非介體傳輸2、種子傳染seed-transmission病毒種傳主要性（1）早期提供毒源，引發(fā)病毒病流行種子帶毒后，直接使幼苗發(fā)病，為大田侵染提供了初侵染源（2）遠程傳輸經過種子進出口、種子調撥使病區(qū)擴大花粉能傳毒，種子一定能傳毒植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第38頁（一）、非介體傳輸3、土壤傳輸soil-transmission病毒進入土壤路徑：（1）病殘體帶入（2）病株根部滲透土壤土傳病毒病害特點：（1）病害開始往往局限于小塊發(fā)病中心（2）傳輸速度慢（3）土壤傳染性可長久保持（4）干燥喪失傳染性-線蟲傳，不然真菌傳植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第39頁（一）、非介體傳輸4、菟絲子傳染Cuscuta可將復合感染病毒分開5、嫁接傳染頂接、側接、靠接、套接受接穗和砧木親和力影響會將病株中其它病毒也同時傳輸植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第40頁(二)介體vectors傳輸1、蟲毒為害和真正病毒病害區(qū)分：

蟲毒病毒病害

0

1、昆蟲分泌對植物有毒物質病毒所致2、毒素在植物體內不能增殖病毒可在植物體內增殖3、中毒植物在一定情況下可恢復極少能恢復4、受害程度與昆蟲飼食時間蟲數(shù)不成正比5、產毒能力有遺傳性只有少數(shù)能經過卵傳6、無性繁殖材料或嫁接不傳可嫁接、無性繁殖材料傳7、防治與控制昆蟲效果成正比常不成百分比植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第41頁主要介體有：昆蟲、真菌、螨類、線蟲類昆蟲介體有：蚜蟲、葉蟬、飛虱、甲蟲、薊馬、粉蚧、蝽象等昆蟲傳毒過程分為：獲毒、潛育、傳毒三個時期獲毒飼育期（acquisitionfeedingperiod）指無毒昆蟲開始取食至已取得傳毒能力所需時間接毒飼育期（inoculationfeedingperiod）指帶毒昆蟲在健康植株上引發(fā)發(fā)病取食時間。潛育期（latentfeedingperiod）指昆蟲從取得病毒起到能傳輸給植物所需時間。(二)介體vectors傳輸植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第42頁按昆蟲獲毒后能保持傳毒時間可分為：非持久性傳輸(nonpersistent)：口針傳輸，病毒在體內短期存在，幾秒~幾分鐘即可獲毒并馬上傳毒，也易喪失傳毒能力持久性傳輸(persistent):昆蟲保持相對較長傳毒時間，數(shù)周~數(shù)月，其病毒可分為：

循回病毒circulativevirus

增殖病毒propagativevirus半持久性傳輸（semipersistent）植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第43頁蚜蟲傳輸（aphidtransmission)在測定過傳病毒242種昆蟲介體中，已證實介體有192種，其中蚜蟲占173種。自然條件下多?？蓚鰿MV有75種，桃蚜能傳100各種病毒為害農作物，難防治。蚜蟲傳有：非持久性花葉、斑駁癥狀

口針被動機械污染主動吸食和回吐病毒半持久性持久性病毒多在韌皮部增殖，不能經汁液摩擦接種植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第44頁aphidtransmissionApterous(wingless)lettuceaphidAnalate(winged)greenpeachaphid植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第45頁WhiteflyTrialeurodes

abutilonea

粉虱Presenceofbeanleafbeetlescanindicatevirusrisk植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第46頁Leafhoppers植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第47頁2、線蟲傳輸nematodetransmission長針線蟲屬Longidorus劍針線蟲屬Xiphenema毛刺針線蟲屬Trichodorus擬毛刺針線蟲屬Paratrichodorus有十各種病毒可線蟲傳，有：番茄環(huán)斑病毒、雀麥花葉病毒、葡萄扇葉病毒、煙草環(huán)斑病毒、煙草脆裂病毒等普通都可經種子傳線蟲與病毒特殊關系由線蟲食道表皮膜蛋白與病毒外殼蛋白之間親和性決定植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第48頁植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第49頁3、真菌傳輸fungitransmission低等真菌：壺菌、根腫菌二種方式：(1)病毒粒子附著在游動孢子周身，鞭毛(2)病毒在休眠孢子中與休眠孢子共存但都無證據(jù)表明病毒在菌體內增殖禾谷多粘菌Polymyxagraminis植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第50頁LightmicrographshowingrestingsporesofOlpidiumbrassicae植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第51頁三、植物病毒傳輸transmissionVirustransportMovementinplant植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第52頁四、植物抗病毒防衛(wèi)反應原理（一）、防衛(wèi)過程植物對病原微生物抗性反應大致分為：組成型抗性

如表皮角質層、氣孔大小等誘發(fā)型抗性依據(jù)寄主和病毒相互作用，可將防衛(wèi)反應分為三個階段：

侵染識別防衛(wèi)反應基因活化表示枯斑產生植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第53頁

hypersensitivereaction(HR)systematicacquiredresistance(SAR)

廣譜抗病性（可抗病毒、真菌、細菌等）Inducinginoculation誘發(fā)接種challengeinoculation挑戰(zhàn)接種四、植物抗病毒防衛(wèi)反應原理植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第54頁防衛(wèi)反應類型1、免疫immune非寄主抗病性（non-hostresistance)

利用——遠緣雜交2、侵染性infectible局部壞死反應，同時誘發(fā)非?；闹鞣佬l(wèi)反應、產生PR蛋白，之后寄主表現(xiàn)局部或系統(tǒng)取得抗病性植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第55頁在防衛(wèi)反應中被誘導

與抗病相關物質1、PR蛋白2、植物次生代謝產物：酚類、類黃酮、生物堿、抗生素類3、植保素(phytoalexin,PA)

廣譜性、非特異性，異黃酮類isoflavonoid4、多酚類化合物5、其它寄主蛋白和酶活性改變

過氧化物酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶等植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第56頁PR蛋白病程相關蛋白(pathogenesis-relatedproteins)1、低分子量（12~45KD）2、抗蛋白酶水解3、酸溶性4、局部分布5、誘導產生大多數(shù)屬于水解酶類，如chitinase,

β-1,3-glucanase等返回植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第57頁酚類化合物在植物抗病中作用1、多酚氧化酶和過氧化物酶等使多酚化合物氧化，氧化產物對菌絲生長有抑制作用2、病原菌分泌細胞壁多糖降解酶，酚類可抑制該酶類3、酚類是木質素前體，酚類物質積累促進木質素合成，使寄主細胞壁加固返回植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第58頁植物防衛(wèi)反應激發(fā)兩類植物基因在起作用：植物抗病基因——決定預先形成抗病能力或使病毒失活蛋白質、酶等各種因子植物防衛(wèi)反應基因——植物抗病基因產物與病毒基因產物互作，誘導防衛(wèi)基因表示植物抗病基因克隆、抗病基因產物及其作用方式、植物防衛(wèi)反應表示調控等問題是當前植物抗病性分子生物學研究熱點植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第59頁植物防衛(wèi)反應激發(fā)病毒外殼蛋白(CP)被認為是誘導寄主HR反應激發(fā)子(elicitor)植物病原細菌毒性基因主要有hrp和dsp基因

hrp(hypersensitivereactionandpathogenicitygene)—控制在非寄主植物上誘導過敏性反應和在寄主植物上決定致病基因，hrp基因編碼產物harpin可誘導非寄主植物產生HR，也是一類激發(fā)子。其它激發(fā)子有：寡糖、多肽、水楊酸、茉莉酮酸等dsp(diseasespecificgene)—只與致病性相關基因植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第60頁五、植物病毒病防治病害三角：1、毀滅侵染起源和傳染介體2、改進植物品種抗病及耐病性3、對已得病作物尋找理化治療方法PathogenEnvironmentHost原理植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第61頁（一）、去除傳染起源種子：豆科、葫蘆科、菊科等、留健種繁殖材料：苗木、接穗、砧木、塊根等雜草、橋梁寄主污染病毒土壤、病殘體(如TNV,TMV)（二）、預防病毒傳輸

1、治蟲：測報、大田誘殺、物理避蟲、隔離栽培、調整播期、殺蟲劑等五、植物病毒病防治植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第62頁(二)、預防病毒傳輸

2、預防接觸傳輸：農事操作、工具等

3、根靠接(果樹)、花粉傳輸預防

(三)、選取脫毒種苗或無病毒種苗

1、繁殖材料檢驗索引法（indexing)

2、病毒在植株體內分布和組織培養(yǎng)

(四)、化學防治

(五)、交叉保護：弱毒株、衛(wèi)星RNA等

(六)、熱處理

(七)、抗病品種五、植物病毒病防治植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第63頁馬鈴薯病毒病防治植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第64頁優(yōu)點：1、一旦對應病毒侵入，其衛(wèi)星RNA就被激活、放大，植物細胞中只要有低濃度RNA轉錄就行；2、衛(wèi)星RNA給植物抗性不會因為病毒接種量而克服；3、抗性取得不產生新異源蛋白，提升了轉基因植物生物安全性。缺點：1、只有少數(shù)病毒含有衛(wèi)星RNA，大大限制了其應用范圍；2、衛(wèi)星RNA有可能被自然病毒載體包裝并釋放到環(huán)境中；3、有些衛(wèi)星RNA可能突變增強病毒致病力或者和植物RNA重組，產生難以預料病癥，限制該技術路線利用。利用病毒衛(wèi)星RNA使植物抗病毒

返回植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第65頁選育抗病品種普通程序確定選育對象品種抗性測定（與病毒株系分化結合）依據(jù)當?shù)仄贩N和分離物研究搜集外地品種和病毒分離物，比較反應差異引進該病毒國外所用判別品種植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第66頁（四）、化學防治化學物質：

金屬鹽類:ZnSO4CaCl2

有機酸類:類黃酮、水楊酸、清潔劑（Tw80、Triton-100）嘌呤嘧啶類：三嗪類、8-偶氮鳥嘌呤維生素類：VB2；植物激素類：赤霉素、激動素蛋白質類氨基酸類:牛奶、原亮氨基酸天然物質：

多糖類

蛋白質類

糖蛋白類蛋白多糖類返回抑制病毒侵染、病毒蛋白合成

分子量在10000~55000Da從微生物代謝產物中提取抗病毒抑制劑植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第67頁六植物抗病毒基因工程

復制酶介導保護作用(ReplicaseMediatedProtection，RPMP)

外殼蛋白介導保護作用(CoatProteinMediatedProtection,CPMP)

移動蛋白介導保護作用(MovementProteinMediatedProtection,MPMP)

病毒基因相關其它序列介導抗性

非病毒起源基因介導抗性

P315-319植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第68頁(一)、復制酶介導保護作用(ReplicaseMediatedProtection，RPMP)

復制酶(RP)是指由病毒編碼，能特異合成病毒+RNA、-RNARNA聚合酶，其關鍵功效是合成全長病毒基因組RNA。

1988年VanＤan等開始嘗試將病毒RP基因轉入植物，當前RPMP已在最少13種病毒(分屬10個植物病毒屬)中進行研究。1）RP介導抗性強若產生抗性，能使轉基因植物產生免疫或高抗。2)連續(xù)時間長普通RPMP展現(xiàn)連續(xù)抗性。六植物抗病毒基因工程植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第69頁(一)、復制酶介導保護作用(RPMP)

3)作用范圍相對較窄

RPMP普通對提供RP基因親本病毒株系有抗性，而對那些與親本株系顯示一定序列差異同種不一樣株病毒不表現(xiàn)抗性。4)可誘導抗性組成型表示RP基因介導抗性絕大多數(shù)是預先建立，一旦接種病毒就會表現(xiàn)。但也有些表現(xiàn)為可誘導抗性。5)抗性表現(xiàn)復雜表現(xiàn)RPMP轉基因植株原生質體均表現(xiàn)抗性，這種單細胞水平抗性說明RPMP抑制了病毒在宿主細胞中復制。有些限制病毒在細胞間移動或經過維管束系統(tǒng)長距離遷移。六植物抗病毒基因工程

植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第70頁(一)、復制酶介導保護作用(RPMP)

RPMP抗性機理：(推測機理)①依賴于基因緘默(genesilencing)抗性機制

位置效應、轉錄水平基因緘默和轉錄后水平基因緘默②蛋白質介導抗性：轉基因表示RP干擾了病毒復制和移動

③形成RNA-RNA抑制雙體：轉基因轉錄產物和接種病毒RNA間形成RNA-RNA復合體，影響了病毒RNA與各種蛋白間互作，從而干擾病毒侵染。

④轉基因產物復制酶作為激發(fā)子引發(fā)宿主防御系統(tǒng)反應

情況可能更復雜，包括各種抗性機理同時起作用六植物抗病毒基因工程

植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第71頁(二)、外殼蛋白介導保護作用(CoatProteinMediatedProtection,CPMP)

研究最早、應用最多植物抗病毒基因工程策略

自1986年成功取得TMVCP介導抗TMV煙草，到當前為止，已針對10多個屬30余種病毒進行了CPMP試驗，轉基因受體植物多達十幾個，其中大多數(shù)轉入CP基因植株對同源性較高同屬大多數(shù)病毒有一定程度抗病性，表現(xiàn)為癥狀減輕或延遲出現(xiàn)，或癥狀限于接種葉片不擴展到新生葉片，病毒含量低或測不到。不足：CPMP普通只是推遲發(fā)病，抗性主要表現(xiàn)在病毒侵染早期，一旦提升病毒接種量或重復接種則抗性破壞。當前傾向于把CPMP與其它抗性基因策略相結合。六植物抗病毒基因工程

植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第72頁(二)、外殼蛋白介導保護作用(CoatProteinMediatedProtection,CPMP)

CPMP機理：以前認為是CP干擾了病毒粒子侵染早期脫衣殼過程，使其無法暴露出內部核酸，進而抑制在宿主體內復制和增殖，故CPMP對接種病毒RNA無效。但越來越多試驗結果使情況變得復雜，發(fā)覺CP能夠影響病毒經過胞間連絲移動，可能參加抑制病毒長距離遷移，抑制病毒復制或作為激發(fā)子識別宿主抗性基因，引發(fā)HR(HypersensitiveResponse)。

六植物抗病毒基因工程

植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第73頁(三)、移動蛋白介導保護作用(MovementProteinMediatedProtection,MPMP)

MP由病毒基因編碼，負責參加病毒在寄主細胞之間傳遞和經過植物維管組織長距離遷移，從而造成寄主整體發(fā)病。只有當轉基因植物表示是失去功效MP時，才能顯示出抗性。而當轉基因表示有功效MP時，或者對病毒侵染無影響，或者反而提升植物感病性。用有運動缺點同源或異源病毒接種這種轉基因植物，病毒能恢復正常胞間轉運甚至能在植物內長距離遷移，從而造成病害加重。它突出優(yōu)點在于——廣譜抗性。六植物抗病毒基因工程

植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第74頁(三)、移動蛋白介導保護作用(MovementProteinMediatedProtection,MPMP)

MPMP機理屬于蛋白質水平介導抗性轉基因表示失去功效MP與接種病毒野生型MP競爭胞間連絲上結合位點許多不一樣病毒MP可能與相同胞間連絲成份起作用(廣譜抗性例子暗示)也可能包括病毒編碼蛋白、病毒基因組和寄主因子間相互作用

六植物抗病毒基因工程

植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第75頁六植物抗病毒基因工程

(四)、病毒基因相關其它序列介導抗性

核酶(Ribozyme，Rz)和反義基因核酶是一個能特異切割RNARNA，依據(jù)已知病毒基因組特定區(qū)域序列設計Rz,使它能特異地識別、切割病毒特定區(qū)域，從而切斷病毒基因組，破壞其生物功效。蛋白酶基因馬鈴薯Y病毒屬病毒編碼NIa(NuclearInclusiona)具蛋白酶性質，表示煙草脈斑駁病毒(TVMV)NIa煙草能抗TVMV;表示PVYNIa煙草能抗PVY。衛(wèi)星RNA和缺損干擾RNA(DefectiveInterfering，DI)Sat-RNA普通與輔助病毒沒有序列同源性，而DI-RNA與輔助病毒有序列同源性，利用Sat-RNA和DI-RNA均能到達干擾病毒復制、擴散及其它生物功效，從而減輕癥狀。反義基因是與目標核酸序列(正鏈或負鏈)互補反義序列，它能夠抑制或封閉目標基因復制、剪接和表示。表示PLRV、TEV、TGMVCP基因反義RNA煙草對各自起源病毒都顯示了較強抗性。核酶和反義基因相結合有望到達更高抗病毒效果。

植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第76頁六、植物抗病毒基因工程

(五)、非病毒起源基因介導抗性

起源于植物本身抗性基因植物抗體(Plantibody)基因核糖體鈍化蛋白(RibosomeInactivatingProtein，RIP)

2’-5’寡聚腺苷(2’-5’-oligo-adenylate,2-5Ａ)系統(tǒng)

2’-5’Ａ系統(tǒng)是高等脊椎動物一個抗病毒機制，它包含2個關鍵酶：2-5Ａ合成酶與依賴于2-5ＡRNaseL，經過病毒侵染形成dsRNA激活2-5Ａ系統(tǒng)，降解病毒RNA，從而阻止其復制及擴散。植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第77頁六、植物抗病毒基因工程

不足與危險性應用前景矚目，美國同意商業(yè)化應用轉基因植物有抗病毒西葫蘆，番茄和番木瓜等，當前國內也有轉基因抗病毒煙草、番茄和甜椒產品獲準商業(yè)化應用。研究方向用各種類型抗性基因來取得廣譜、高程度抗性。如作用于病毒侵染早期CPMP，廣譜MPMP與作用于侵染后RPMP相結合；開展基礎研究，探討抗性機理，以求更準確有效地導入適當外源基因；揭示植物本身防御機制以提升植物內在抗性；用基因工程技術將綜合性狀，質量性狀基因一起導入目標植物，再與常規(guī)育種相結合，培育抗病毒、高品質新品種。植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第78頁七、植物病毒檢測主要方法生物學特征測定：在判別寄主上反應、癥狀、傳輸?shù)蕊@微鏡觀察：內涵體、病毒粒子、定位分布等免疫學特征測定：以血清學和組織免疫化學方法檢測材料帶毒情況、多克隆抗體、單克隆抗體分子生物學技術判定：核酸分子雜交、PCR等分子標識技術（AFLP、RFLP、RAPD）植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第79頁生物學判定依靠寄主植物和病毒傳輸方式寄主病癥、寄主范圍、介體、交叉保護現(xiàn)象等依靠癥狀診療不完全可靠：不一樣病毒在同種植物產生相同癥狀同種病毒在植物不一樣栽培品種上癥狀不盡一致同種病毒不一樣株系可產生不一樣癥狀復合侵染常有潛伏侵染不一樣土壤和氣候條件可改變癥狀植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第80頁判別寄主檢驗馬鈴薯病毒在判別寄主上癥狀表現(xiàn)

檢驗病毒接種植物檢驗時間癥狀表現(xiàn)

PVX千日紅5~7d葉面有紅色環(huán)形枯斑PVM千日紅12~24d葉面有紫紅色小枯斑PVS千日紅14~25d葉面有桔紅色小枯斑PVG心葉煙20d系統(tǒng)性白斑花葉PVY普通煙7~10d明脈，后脈?；ㄈ~PVA香料煙7~10d明脈PSTV莨菪5~10d沿脈出現(xiàn)褐色環(huán)死斑植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第81頁TestingforSoybeanViruseswithIndicatorPlantsHypersensitivity——Someplantsarepredictably

sensitivetoaspecificvirus.Thehypersensitiveplantsarecalledindicatorplants,andareusedasabioassaytotestforthepresenceofvirusinanunknownsample1植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第82頁Materials:gloves,sterilecottonswabs,rinsebottle,tissuegrindingbagsandcarborundum-siliconcarbidewhichisusedasatissueabrasive2植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第83頁Plantsapismadefromtheplanttobetestedforvirusbypullingoffasymptomaticupperleaf3植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第84頁placingtheleafinasterileplasticbag.addingbuffersolutiontothebag.grindtheleaftissuetoreleasethevirusparticlesintothebuffer.4植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第85頁sprinkleabitofcarborundumontheplanttobeinoculated.Justalightdustingissufficienttoprovideenoughabrasiontointroducevirusintotheplantcells.5植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第86頁inoculatetheindicatorplant,acottonswabisimmersedinplantsaprubthesurfaceofthetestplantleaffirmly,butnotwithenoughforcetoteartheleaf6植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第87頁7rinseoffthecarborundumexcesssapfromtheleafwithwatertoremovecompoundsthatcouldinterferewiththeinfectionprocess植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第88頁8Theindicatorplantsareplacedinthegreenhouseandcheckeddailyforsymptoms.Ifcharacteristicsymptomsappear,weknowthatvirusparticleswerepresent植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第89頁光鏡與電鏡觀察光鏡用于植物病毒內涵體細胞學研究內涵體類型、形態(tài)、組成、亞結構及其位置等電鏡(生物樣品分辨率3~5nm,0.1~0.2nm)觀察病毒詳細結構、形態(tài)特征電鏡負染技術:快速、簡單和直接，但需要一定技能，而且工作比較集中，所以樣本數(shù)量大則不易處理。(磷鎢酸及其鉀或鈉鹽作負染劑）免疫吸附電鏡技術（ISEM）：電鏡與血清學技術結合：如膠體金免疫電鏡技術成功用于檢測病汁液中不一樣形態(tài)病毒。ISEM普通是把抗體先吸附在電鏡銅網(wǎng)支架膜上，加上抗原，然后再加第二次抗體，最終用醋酸鈾作負染色。如抗原和抗體二者有反應，則第一次抗體可把抗原“捕捉”于銅網(wǎng)上。第二次抗體處理則使抗原粒子四面包被抗體分子，負染色結果在抗原粒子四面形成一“抗體暈”。在電鏡觀察中，使抗原更為突出，易于觀察。植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第90頁光鏡與電鏡觀察免疫吸附電鏡技術(ISEM)：特點：利用電鏡高度放大率和分辨能力，直接對細胞內抗原定位，看到抗原與抗體之間特異性反應和免疫復合物形態(tài)學特征，含有高度敏感性和特異性。當被測樣本小時，它尤其適用。應用：廣泛用于檢測和判定植物病汁液中不一樣形態(tài)（線狀、棒狀和球狀）病毒。1973年創(chuàng)造以來，已成為植物病毒研究一個主要伎倆，尤其是膠體金免疫電鏡技術。植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第91頁光鏡與電鏡觀察免疫電鏡負染結果觀察到大量圓形病毒顆粒，直徑為20～22nm

植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第92頁光鏡與電鏡觀察免疫吸附電鏡技術(ISEM)A

金顆粒特異性地標識在病毒粒子囊膜表面纖突上B單抗與甲醛固定病毒粒子發(fā)生特異性反應植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第93頁Pinwheels,ScollsandLaminatedAggregatesPotyvirusCylindricalInclusions

Pinwheels,Scolls,andshortCurvedLaminatedAggregates植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第94頁采取幾個電鏡技術觀察病毒粒子形態(tài)Orfvirus：口瘡病毒(接觸性膿皰皮炎)Ebolavirus埃博拉病毒（正染技術）Vacciniavirus痘苗病毒（投影技術）負染技術植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第95頁免疫學方法在病毒檢測中應用最廣泛有：

ELISA(enzymelinkedimmunosorbentassay)優(yōu)點：具免疫熒光法和放射免疫法反應靈敏、特異性強優(yōu)點、克服常規(guī)血清學方法中受病毒濃度、粒子形態(tài)和抗血清用量等缺點。方法：間接法、雙抗體法、雙夾心法、競爭法應用：ELISA反應快速便利，適合于大規(guī)模田間樣本常規(guī)病毒檢測，也廣泛用于脫毒植物、無性繁殖苗木以及種子上病毒檢測。植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第96頁酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）間接法雙抗體夾心法競爭法直接法雙夾心法非標識抗體酶法原理：酶標抗體抗原酶標抗原抗體復合物底物產物顯色劑比色測定酶促反應將酶標識抗原或抗體吸附到適當載體上進行抗原—抗體反應及酶催化反應。植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第97頁免疫學方法在病毒檢測中應用最廣泛有：免疫擴散（單向與雙向）用于比較同源、異源抗原，可區(qū)分病毒不一樣種和不一樣株系。斑點免疫結合測定法（DIBA）以硝酸纖維薄膜為載體進行酶聯(lián)免疫吸附測定。硝酸纖維膜比酶聯(lián)板廉價而且攜帶方便，進行田間病害診療時，可直接用病毒粗汁液進行大量樣本測定。比ELISA簡單，試驗流程短，不需任何特殊設備，而且靈敏度高?？乖?抗體吸附在NC膜上，經過與對應抗體/抗原和酶標識物反應形成酶標識抗原-抗體復合物，加入對應底物后顯色，展現(xiàn)肉眼可見顏色斑點，依據(jù)顏色有沒有和深淺判定。植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第98頁免疫學方法免疫擴散用于比較同源、異源抗原，可區(qū)分病毒不一樣種和不一樣株系有共同抗原，但不完全相同不一樣抗原植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第99頁免疫學方法在病毒檢測中應用最廣泛有：組織印跡法在ELISA基礎上發(fā)展起來植物病毒檢測技術保持ELISA對病毒檢測靈敏度高、特異性強特點，而且大大地簡化了操作程序，對病毒檢測愈加快速、簡單、方便。印跡在硝酸纖維膜上樣品能保留3個月以上，檢測結果能直觀地顯示出病毒感染部位。尤其適合用于植物病毒大規(guī)模普查，是近年來國外對植物病毒檢測廣泛采取技術。植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第100頁植物病毒檢測——組織印跡法1、基本原理與間接ELISA相同，首先將待測樣品印跡在固相載體——NC上，用病毒家兔特異性抗體(Ig)與吸附在固相載體上病毒進行特異性反應，再與堿式磷酸酶(AlkalinephosphataseAP)標識第二抗體（羊抗兔Fc）進行反應，最終用堿式磷酸酶反應底物BCIP/NBT(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/nitrobluetetrazolium)進行顯色反應，依據(jù)顏色改變，確定病毒感染程度。植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第101頁植物病毒檢測——組織印跡法詳細反應：堿式磷酸酶（AP）以硝基酚磷酸鹽為底物，在pH9.5條件下產生不溶性藍色。(辣根過氧化物酶HRP是以H2O2為底物,需要供氫體如四甲基聯(lián)苯胺(TMB)參加，在pH5.0條件下產生可溶性黃色產物，需借助比色分析.)植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第102頁植物病毒檢測——組織印跡法植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第103頁植物病毒檢測——組織印跡法基本步驟1、采樣3、封閉2、點樣4、洗滌5、病毒與特異抗體反應6、洗滌7、第二抗體連接反應8、洗滌9、顯色反應10、終止顯色11、干燥保留采取植物葉、莖根等，防止手與樣品傷口接觸，裝入塑料袋。將NC膜置于平整齊凈濾紙上，用手術刀片橫切樣品，將切口均勻壓印在膜上，印跡清楚為宜，每張膜上可排列數(shù)百個樣品，設正負對照。將點好樣膜置于盛有2％脫脂奶粉PBS封閉液培養(yǎng)皿中，封閉液用量以覆蓋膜為宜．在37℃下溫浴lh或4℃過夜用PBS-Tbuffer洗膜3次，5min/次將清洗后膜轉入含有特異性抗體封閉液或PBS緩沖液培養(yǎng)皿中，37℃下溫育3h或4℃過夜7洗畢，將膜轉入含堿式磷酸酶標識羊抗兔第二抗體PBS緩沖液中，37℃下溫育3h或4℃過夜9將NC膜轉入顯色液中直至陽性對照顯色為止（5~10min）10待陽性對照顯示清楚紫藍色時，將膜轉入蒸餾水中．終止反應終止反應后．將膜放置于潔凈衛(wèi)生紙之間，使之干燥，待完全干燥后過塑，便永久保留和觀察植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第104頁植物病毒檢測——組織印跡法靈敏度一次切割，連印45次（蕙蘭花葉病毒）感病葉汁液稀釋1：100000，均呈+靈敏度可達20pg/ml(1pg=1×10-12g)較ELISA方法靈敏2～3個反應級植物病毒醫(yī)學宣教專家講座第105頁免疫學方法