高效液相色譜法-2016

第三章高效液相色譜法HighPerformanceLiquidChromatography(HPLC)一、高效液相色譜中的速率方程

遷移的流動相滯留的流動相渦流擴散項縱向擴散流動相傳質(zhì)滯留區(qū)傳質(zhì)固定相內(nèi)傳質(zhì)結(jié)論:

提高柱效的關(guān)鍵是用小粒徑填料：超高壓液相UPLC

流動相粘度↓,n↑：高溫液相色譜低流速，高柱效二、高效液相色譜儀1.儀器流程123123溶劑瓶溶劑瓶123234并聯(lián)柱塞泵（左圖）和串聯(lián)柱塞泵（右圖）1.單向閥；2.柱塞桿；3.泵腔；4.脈沖阻尼器高壓泵六通進樣閥2.檢測器

紫外檢測器（UVD）示差折光檢測器（RID）熒光檢測器（FD）蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）電化學檢測器固定波長可變波長二極管陣列(DAD)(1)紫外檢測器A.固定波長的紫外檢測器典型的流通池結(jié)構(gòu)

B.可變波長的紫外檢測器C.二極管陣列檢測器3-DplotofDAD可得到每個峰的光譜圖可進行譜庫檢索可進行純度檢驗可進行多波長定量D.紫外檢測器的特點選擇性檢測器高靈敏度線性寬穩(wěn)定可做梯度HPLC的常規(guī)檢測器通過選擇合適的檢測波長來提高方法的選擇性(2)示差折光檢測器A.結(jié)構(gòu)通用靈敏度低溫度敏感改變流動相要重新平衡體系不能做梯度B.示差折光檢測器的特點(3)熒光檢測器A.結(jié)構(gòu)高選擇性高靈敏度干擾少可做梯度激發(fā)波長和發(fā)射波長皆可變化B.特性(4)蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)A.原理和結(jié)構(gòu)I=a.mblgI=blgm+lga1-色譜柱；2-噴霧氣體；3-蒸發(fā)漂移管；4-樣品液滴；5-激光光源；6-光二極管檢測器7-散射室

通用型靈敏度較高方便可梯度響應(yīng)與質(zhì)量有關(guān)B.ELSD的特性(5)電化學檢測器Conductivitydetection:電導檢測器DCAmperometricdetection:直流安培檢測器Integratedandpulsedamperometric：積分或脈沖安培A.分類選擇性檢測器靈敏度高電導檢測器是離子色譜的常規(guī)檢測器DCamperometry:氰、硫離子和有機芳香胺、酚等Pulsedamperometry:糖類、氨基酸和脂肪胺類化合物及有機等硫化合物B.特點3.儀器附件Degas在線脫氣機Gradient梯度洗脫裝置ColumnThermostat柱溫箱Autosampler自動進樣器Fractioncollector餾分收集器梯度洗提梯度洗脫即程序控制流動相的組成，使在整個分離過程中，溶劑強度按照特定的變化規(guī)律增加。優(yōu)點：分離復雜混合物，使所有組分都處在最佳的k值范圍內(nèi)。溶劑A溶劑B電磁閥A電磁閥B混合室泵溶劑A溶劑B高壓泵A

高壓泵B混合室低壓溶劑梯度方框圖高壓溶劑梯度方框圖實現(xiàn)方式對于復雜樣品，線性梯度是最好的。正相色譜中，常用二氯甲烷加入到正己烷中來實現(xiàn)。反相色譜中，乙腈，甲醇加入到水中是最常用的。三、HPLC主要類型及其選擇

化學鍵合相色譜法液固色譜法離子對色譜法離子色譜法體積排阻色譜法1.鍵合相色譜法（1）鍵合相色譜法的分類和分離機理正相色譜：流動相極性<固定相極性分配機理反相色譜：流動相極性>固定相極性疏溶劑（水）作用機理拓展知識：HILIC（親水相互作用色譜）反相鍵合相色譜法的疏水機理：溶質(zhì)進入極性流動相(水）后，其疏水基團由于水的斥力與非極性固定相上的烷基締合，構(gòu)成單分子吸附層。當流動相極性減小時，這種疏水斥力下降。類型分離方式應(yīng)用特點C-18反相、離子對普適性好，保留值大。溶于水的高極性化合物、中等極性化合物C-8反相、離子對與C-18類似，保留值略小C-3,C-4反相保留值小，適合肽類和蛋白質(zhì)苯基反相保留適中，選擇性不同。非極性、中等極性化合物-CNHILIC、正相、選擇性與硅膠類似，保留小，用途較廣-NH2HILIC、正相分離糖類、核苷酸、固醇等二醇基HILIC、正相分離有機酸、排阻分蛋白質(zhì)等醚基反相、正相分離酚類、芳硝基化合物，保留比C-18強聚苯乙烯基反相pH使用范圍廣，對部分分離峰形好，壽命長（2）常用固定相固定相的碳鏈長度對保留時間的影響固定相的商品牌號對分離的影響（3）流動相表征溶劑特性的重要參數(shù)溶劑強度ε°：溶劑分子與吸附劑的親合程度溶解度參數(shù)δ：衡量溶劑極性強度的指標。是溶劑和溶質(zhì)分子間色散力、偶極力、接受質(zhì)子或給予質(zhì)子能力的總和。δ相近的溶劑，選擇性α不同。粘度η：溶劑的選擇原則

具有穩(wěn)定的化學性質(zhì)；溶劑與檢測器兼容粘度要??；沸點不太低；純度高且價格便宜

正相：正己烷/正庚烷為主體，加入質(zhì)子受體乙醚或甲基叔丁基醚，質(zhì)子給體氯仿，偶極溶劑二氯甲烷等反相：以水為主體，加入質(zhì)子受體甲醇，質(zhì)子給體乙腈，偶劑溶劑四氫呋喃。

（4）影響保留值的因素溶質(zhì)結(jié)構(gòu)對保留值的影響：正相：溶質(zhì)極性越強，官能團越多，保留值越大反相：溶質(zhì)極性越弱，疏水性越強，保留值越大。溶質(zhì)的保留值與其分子非極性部分的總面積有關(guān)，面積大，保留值大。烷基鍵合固定相特性對保留值的影響：反相：鍵合相烷鏈長，k大，選擇性好溶劑性質(zhì)：正相：溶劑極性越弱，保留越大反相：流動相表面張力大、介電常數(shù)大，則極性越強。其斥力越大，溶質(zhì)與固定相鍵合越強，保留值越大。pH值的影響加入酸、堿或緩沖液，控制pH，抑制溶質(zhì)的離子化，改善峰形。用于分析弱酸、堿。鹽的影響：通常加入醋酸鹽、硼酸鹽、磷酸鹽等。抑制溶質(zhì)的離子化，改善峰型，抑制拖尾，提高保留時間的重復性。影響流動相的表面張力，所以對中性化合物的保留時間也略有影響。8種人參皂苷的k值與流動相離子濃度的關(guān)系應(yīng)用2離子對色譜法

Ion-pairchromatography

（1）基本原理將一種或數(shù)種與樣品離子電荷（A+）相反的離子(B-)（稱為對離子或反離子）加入到色譜系統(tǒng)流動相中，使其與樣品離子結(jié)合生成弱極性的離子對（中性締合物）的分離方法。多為反相離子對色譜

（2）固定相、流動相和離子對試劑固定相：多為C18,C8反相鍵合相流動相：是以水為主的緩沖液，或水-甲醇、水-乙腈等混合溶劑離子對試劑：四丁基銨正離子、十六烷基三甲基銨正離子，ClO4-，十二烷基磺酸根等

（3）影響保留值的因素pH的影響：改善分離選擇性的有效方法。反相中，對于陰離子的分離，pH下降，k減小。離子對試劑的性質(zhì)與濃度：反相中，離子對試劑烷基鏈越長，疏水性越大，k越大。溶劑的極性：反相中，甲醇、乙腈等含量增加，洗脫強度增大，k下降。洗脫強度與極性參數(shù)、介電常數(shù)同時相關(guān)離子強度：反相中，離子強度增加，溶質(zhì)k下降（4）應(yīng)用

有機酸、有機堿特別是強酸、強堿的分析：如羧酸、磺酸、胺類、酚類、藥物、染料等反相離子對色譜分析有機酸固定相：C18烷基鍵合相流動相：0.03mol/L四丁基銨+戊醇

1.4-氨基苯甲酸；2.3-氨基苯甲酸；3.4-羥基苯甲酸；4.3-羥基苯甲酸；5.苯磺酸；6.苯甲酸；7.甲苯-4-磺酸3.液固色譜法（1）分離機理以固體吸附劑為固定相的液相色譜法溶質(zhì)分子和流動相分子在吸附劑表面的吸附活性中心上進行競爭吸附（2）固定相極性：硅膠、氧化鎂、氧化鋁等非極性：活性炭、高分子多孔微球、碳多孔微球等（3）流動相ε°越大，洗脫力越強。硅膠為固定相時：以正構(gòu)烷烴為主體，加入二氯甲烷調(diào)節(jié)合適的洗脫強度?？捎盟畬枘z進行減活處理，或加入四氫呋喃、乙腈、甲醇、異丙醇等改性劑（4）影響保留值的因素樣品分子結(jié)構(gòu)溶質(zhì)分子的官能團極性增加，保留值增加溶質(zhì)分子的官能團數(shù)目增加，保留值增加保留值與溶質(zhì)的空間效應(yīng)有關(guān)保留值與吸附中心的幾何分布有關(guān)吸附劑吸附劑的孔徑越小，表面積越大，保留值越大吸附劑的活性越強，保留值越大流動相D.應(yīng)用中等分子量的油溶性樣品如油品、脂肪、芳烴等不同極性取代基的化合物結(jié)構(gòu)異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體混合物的分離4.離子色譜法

(1)分離機理不同的離子與樹脂離子的交換能力（親和能力）不同，親和力越大，離子越難洗脫，從而得以分離（2）離子色譜的儀器離子色譜的分離原理與離子交換色譜一樣。最大的改進是解決了微量組分的檢測問題。

雙柱抑制型：在分離柱和檢測器之間加一個化學抑制器，其作用有二，一是降低淋洗液的背景電導，二是增加被測離子的電導值，改善信噪比。靈敏度高。

單柱非抑制型：淋洗液直接進入電導檢測器。簡單、分辨率較好。無抑制器CounterIonsTimeTime有抑制器FSO42CI---FSO42CI---Y+Na+

X-:

樣品中的陰離子Y+:

樣品中的陽離子H2OH2OOH-Na+Y+H2ONa+Y+

X-

Na+CO32-(樣品,淋洗液)H+H++CO32-H++X-

至檢測器H2CO3H+X-H+

+O2H2OH2

+OH-H2ONa+OH-,H2H2O,O2廢液廢液電極（－）電極（＋）純水或來自檢測器的流體

H+H+H+H+陽離子交換膜陽離子交換膜抑制器的工作原理(陰離子)（2）固定相離子交換劑，根據(jù)功能基可分為：強酸型（磺酸基團）、強堿型（季銨基）、弱酸型（羧酸）、弱堿型（伯、仲、叔胺）等（3）流動相雙柱抑制型：分離陽離子，一般采用無機酸如HCl，HNO3等；分離陰離子，一般采用NaOH、NaHCO3/NaCO3。單柱非抑制型：分離陽離子，用低濃度的HCl，HNO3等；分離陰離子，可用苯甲酸及其鹽、酒石酸、檸檬酸等（4）影響保留值的因素溶質(zhì)無機陰離子：與水合離子的半徑有關(guān)，半徑越大，保留值越大。還與離子的價態(tài)有關(guān)，價數(shù)越高，保留越強。有機陰離子：一元脂肪酸<一元芳香酸<二元脂肪酸<二元芳香酸，并于Pka有關(guān)陽離子：與價數(shù)及分子大小有關(guān)固定相：選擇性的改變主要通過固定相來實現(xiàn)。選擇性與固定相的組成（如交聯(lián)度）、交換基團的結(jié)構(gòu)、位置都有關(guān)。流動相的組成：組成不同，保留和選擇性不同。流動相的濃度：濃度高，k下降，由于下降幅度與離子電荷數(shù)有關(guān)，因此用于改變一價離子和二價離子的選擇性流動相的離子強度：離子強度增加，k下降流動相的pH：pH升高，陽離子交換色譜中，陽離子的保留值下降；因離子交換色譜中，陰離子保留值增加有機調(diào)節(jié)劑：如甲醇、丁醇、乙腈等。影響選擇性。注意與柱的匹配。

（5）應(yīng)用分析無機陰離子的首選方法還可用于分析無機陽離子，有機酸、堿，糖類、蛋白質(zhì)等。多聚磷酸鹽的分析Column: IonPac?AG14,AS14

Eluent: 3.5mMSodiumcarbonate

1mMSodiumbicarbonate

FlowRate: 1.2mL/min

Inj.Volume: 10

L

Detection: Suppressedconductivity,ASRS,

AutoSuppression?recyclemode

Peaks: 1. Fluoride 5 mg/L

2. Acetate 20

3. Chloride 10

4. Nitrite 15

5. Bromide 25

6. Nitrate 25

7. Phosphate 40

8. Sulfate 30010

SMinutes0246810121412345678常見陰離子分析5.體積排阻色譜法

（1）分離原理以多孔凝膠為固定相，利用精確控制的凝膠孔徑，使樣品中不同分子大小的組分得以分離。用于分子大小差大于10%的樣品。VR=V0+KD·Vp0<KD<1.0洗脫體積在V0

和V0+Vp之間，峰容量有限，10-12個峰GFC(GelFiltrationChromatography)使用水溶液的凝膠過濾色譜法，用于分析多肽、蛋白質(zhì)、核酸、多糖等。GPC(GelPermeationChromatography)使用有機溶劑的凝膠滲透色譜法，用于高聚物（如聚乙烯、聚氯乙烯等）分子量的測定。（2）固定相硬質(zhì)凝膠高交聯(lián)度苯乙烯、二乙烯苯共聚物：凝膠滲透色譜法多孔球形硅膠：凝膠過濾色譜法、凝膠滲透色譜法羥基化聚醚多孔微球：凝膠過濾色譜法特性參數(shù)：滲透極限，分離范圍，固流相比（凝膠孔體積Vp/顆粒間體積Vo），柱效（3）流動相改善分離主要通過固定相來實現(xiàn)。流動相的選擇原則是：能溶解樣品與凝膠浸潤與檢測器匹配粘度小如四氫呋喃；緩沖溶液（4）應(yīng)用（分子量的測定）（1）了解分析對象和分析要求6.液相色譜分離類型及條件選擇Whatisthesample?Concentrationoftheinterestedcomponent（組分濃度？）Contaminant（干擾物？）Characteristicsoftheanalyte?Structure（結(jié)構(gòu)）Molecularweight（分子量）pKa（酸堿性）Solubility（溶解度）（2）高效液相色譜分離類型及儀器條件采用何種高效液相色譜類型？對儀器有什么要求，類型？梯度？制備？采用何種檢測器？采用什么色譜柱？（3）選擇合適的分析條件流動相條件檢測器的參數(shù)溫度流速樣品的前處理方