GB∕T 18647-2020 動物球蟲病診斷技術(shù)

B41中華人民共和國國家標準代替GB/T18647—2002動物球蟲病診斷技術(shù)2020-12-14發(fā)布2020-12-14實施國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準代替GB/T18647—2002《動物球蟲病診斷技術(shù)》。本標準與GB/T18647—2002相比，除編輯性修改外，主要技術(shù)變化如下：年版的—“病理檢查”中裂殖子／裂殖體檢查部分增加了對兔肝臟和鴨、鵝腎臟的檢查（見5.3.1);—“球蟲卵囊形態(tài)特征”部分增加了不同屬球蟲卵囊的大小和模式圖（見附錄B)。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別這些專利的責任。本標準由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本標準由全國動物衛(wèi)生標準化技術(shù)委員會(SAC/TC181)歸口。本標準起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所。ⅠⅡ球蟲病(是多種動物的一種重要寄生蟲病，各國均有發(fā)生，對家畜、家禽、寵物、魚類和野生動物等均有不同程度的危害，特別在集約化養(yǎng)殖中，若控制不嚴，會造成重大經(jīng)濟損失。本病對家禽和兔危害較大，急性暴發(fā)的死亡率可超過其次是豬、牛、羊等家畜，急性感染常引起下痢，生長嚴重受阻；犬、貓球蟲病也較為常見，可引起消瘦、貧血、腹瀉及生長發(fā)育受阻，嚴重時可導致死亡；也偶有魚類和野生動物發(fā)生球蟲病的報道。本病的病原為頂復器門(類椎體綱(真球蟲目艾美耳科等孢屬泰澤屬溫揚屬（wenYonella）球蟲。每種動物都有各自特有的球蟲種類，文獻記錄的畜禽和野生動物球蟲種類已達2000多種。國內(nèi)外對球蟲病的經(jīng)典診斷方法是病原檢查，并結(jié)合臨床癥狀和病理剖檢進行綜合診斷。盡管國內(nèi)外學者建立了免疫學、血清學和分子生物學等多種診斷技術(shù)，如色素試驗法、子孢子制動反應、間接血凝試驗、免疫熒光抗體試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、免疫細胞化學技術(shù)、隨機引物擴增多態(tài)性DNA(RAPD)和聚合酶鏈式反應(PCR)等，但由于這些方法檢出的準確性和操作復雜等問題，尚不能代替現(xiàn)有方法。病原檢查和綜合診斷技術(shù)仍是目前最常用的方法。綜合診斷主要用于發(fā)病或死亡后的診斷，確定動物或動物群是否因感染球蟲而發(fā)病或死亡。病原檢查簡單、易行，既可定性，又可定量，既可用于發(fā)病前，又可用于發(fā)病后，以確定動物或動物群感染球蟲的程度。病原檢查可廣泛用于流行病學調(diào)查、防治藥物的篩選和臨床驗證、進出口檢疫、無本病健康動物群的建立等。為了規(guī)范球蟲與球蟲病的檢疫方法，使得檢出結(jié)果客觀、準確、一致，以保證《中華人民共和國動物防疫法》的實施，特制定本標準。1動物球蟲病診斷技術(shù)本標準規(guī)定了動物球蟲病的臨床診斷、病原檢查、病理檢查、綜合判定的技術(shù)要求。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682—2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法NY/T541—2016獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范3臨床診斷根據(jù)發(fā)病臨床特征，球蟲病可分為急性型和慢性型。急性型多發(fā)生于幼齡動物，病程初期表現(xiàn)為精神沉郁，嗜睡，被毛粗亂，食欲下降，腹瀉。病程后期出現(xiàn)運動失調(diào)，食欲廢絕，排出帶血水樣稀便，甚至是血便，具惡臭味，可視黏膜貧血、蒼白，身體消瘦，甚至失重，最后因脫水、衰竭而死。慢性型多見于大齡動物，無明顯癥狀，主要表現(xiàn)為厭食，間歇性下痢，逐漸消瘦，生產(chǎn)性能下降等。有以上臨床癥狀者，可以懷疑為球蟲病，確診需進一步進行病原或病理檢查。4病原檢查4.1.1試劑：飽和鹽水，2.5%重鉻酸鉀溶液，配制方法分別見附錄A中A.1和A.2,配制用水符合GB/T6682—2008三級水要求。杯、50mL離心管、10mL玻璃瓶、吸管、鑷子、天平、離心機、麥氏蟲卵計數(shù)板、載玻片、蓋玻片、顯微鏡等。4.2樣品采集、保存和運輸4.2.1動物糞便的采集：對家禽、犬、貓、兔等小型動物，若是群體采樣，采集新鮮糞便不少于200g,若是個體采樣，采集新鮮糞便不少60g;對豬、牛、羊、馬等大型動物，若是群體采樣，采集新鮮糞便不少于300g,若是個體采樣，采集新鮮糞便不少100g。4.2.2樣品的保存：樣品采集后置于樣品保存袋中，封口后，每份樣品的包裝袋上均要貼上標簽，寫明采集地點、采集時間、動物種類、動物年齡、糞便性狀等詳細資料，置于2℃~8℃冰箱內(nèi)保存。4.2.3樣品的運輸：以最快最直接的途徑將所采集的樣品送往實驗室進行檢測，運輸條件符合NY/T541—2016要求。24.3.1.1將被檢動物或動物群的新鮮糞便充分攪勻后取10g,放入50mL燒杯中，加入適量水。網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾。將濾液移入試管離心4.3.1.4傾去上清液，沉淀物中加入少量飽和鹽水，混勻，將管內(nèi)的沉淀物混懸液移入10mL玻璃瓶內(nèi)。4.3.1.5用飽和鹽水加滿玻璃瓶，蓋上蓋玻片（蓋玻片應與液面接觸靜置10min。4.3.1.6取下蓋玻片，將有液體的一面蓋在載玻片上。4.3.1.7置載玻片于顯微鏡載物臺上，用10×10或10×40的倍數(shù)進行檢查。4.3.1.8定性檢查的判定標準如下：a)發(fā)現(xiàn)球蟲卵囊，判為陽性，說明該動物（群）已感染球蟲。將球蟲陽性糞樣置于2.5%重鉻酸鉀溶液中，在25℃~28℃環(huán)境中培養(yǎng)至孢子化卵囊后，參見附錄B球蟲卵囊形態(tài)特征，確定為哪一屬的球蟲。b)未發(fā)現(xiàn)球蟲卵囊，需從4.3.1.1開始重復檢查5次，仍未見球蟲卵囊，該糞樣可判為陰性。對于家禽、犬、貓等，需連續(xù)采集糞便7d~10d,每天檢查，均未發(fā)現(xiàn)球蟲卵囊，方可說明該動物（群）未感染球蟲；而對于豬、牛、羊、馬、兔等發(fā)現(xiàn)球蟲卵囊，說明該動物（群）未感染球蟲。4.3.2.1對定性檢查中呈陽性的糞樣，需進行定量檢查。4.3.2.2每份糞樣取3個重復，每個重復根據(jù)待檢動物種類不同取不同糞便量，家禽、犬、貓、兔等小型動物取糞樣2g,豬、牛、羊、馬等大型動物取糞樣10g,放入50mL燒杯。4.3.2.3加入適量自來水攪勻，經(jīng)60目銅絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾，用少量自來水沖洗3次~5次濾網(wǎng)；對于豬、牛、羊、馬等大型動物，濾液再經(jīng)100目銅絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾，用少量自來水沖洗3次~5次濾網(wǎng)。將濾液移入試管離心棄去上清液。4.3.2.5用少量飽和鹽水將沉淀物攪勻，移入100mL量筒，加飽和鹽水至60mL處，充分混勻。4.3.2.6用吸管吸取混懸液注滿麥氏蟲卵計數(shù)板的2個計數(shù)室，靜置5min。4.3.2.7將麥氏蟲卵計數(shù)板置于顯微鏡下檢查，用10×10的倍數(shù)數(shù)出每個計數(shù)室(1cm×1cm×將兩個計數(shù)室的卵囊數(shù)之和除以2即得卵囊平均值。對壓線的卵囊，按左、上壓線計，右、下壓線不計處理。根據(jù)每個重復的卵囊平均值，計算出三個重復的平均值犃。等動物的OPG按式(2)計算： 4.3.2.9對卵囊數(shù)較多的糞樣，可在60mL總體積的基礎(chǔ)上，用飽和鹽水再稀釋犅倍后計數(shù)，家禽、犬、貓、兔等動物的OPG按式(3)計算，豬、牛、羊、馬等動物的OPG按式(4)計算： 4.3.2.10定量檢查的判定標準如下：,為嚴重感染；3,為中度感染；,為輕度感染。5病理檢查5.1.1磷酸鹽緩沖液(PBS),配制方法見A.3,配制用水符合GB/T6682—2008三級水要求。或1005.1.3疑為發(fā)生球蟲感染致死或?qū)⒁劳龅膭游铩?.2病變檢查5.2.1對疑為球蟲感染致死或?qū)⒁劳龅膭游镞M行解剖，觀察病變情況。5.2.2主要檢查球蟲寄生部位（器官）的病變。大多數(shù)的球蟲寄生于腸上皮細胞，若腸道明顯腫大、脹氣或變形，腸漿膜面出現(xiàn)針尖大小、顏色為鮮紅色、褐色或白色的斑點或斑塊或結(jié)節(jié)；腸內(nèi)容物充滿血凝塊、脫落的上皮細胞、纖維素樣物、黏液等，呈暗紅色、橙黃色或乳白色，多為稀薄狀；腸黏膜增厚，有壞死的病灶等，可疑為球蟲病，進一步做裂殖子、裂殖體或卵囊檢查。5.2.3對兔，還應檢查肝臟；對鴨、鵝，還應檢查腎臟；若這些臟器上有灰白色的斑點或斑塊，可疑為球蟲病，進一步做裂殖子、裂殖體或卵囊檢查。5.3.1取病變明顯的腸道，縱向剪開，用磷酸鹽緩沖液輕輕洗去黏膜表層的雜物，刮取少許黏膜；對兔或鴨、鵝，還應分別刮取肝臟或腎臟灰白色的斑點或斑塊。5.3.2將刮取物放在載玻片上，滴1滴~2滴磷酸鹽緩沖液，加蓋玻片，置于顯微鏡載物臺上。判為球蟲感染。5.4.1將病變明顯的腸道，縱向剪開，取少量內(nèi)容物，放在載玻片上，滴1滴~2滴磷酸鹽緩沖液，加蓋玻片，輕輕將內(nèi)容物壓散，置顯微鏡下檢查，若見大量球蟲卵囊（形態(tài)參見附錄B),判為球蟲感染。5.4.2或取有灰白色斑點或斑塊的腸道，縱向剪開，用磷酸鹽緩沖液輕輕洗去黏膜表層的雜物，刮取少許有灰白色斑的黏膜，放在載玻片上，滴1滴~2滴磷酸鹽緩沖液，加蓋玻片，輕輕將黏膜內(nèi)容物壓散，置顯微鏡下檢查，若見大量球蟲卵囊，判為球蟲感染。5.4.3對疑為兔或鴨、鵝的球蟲病，從有灰白色斑點或斑塊的肝臟或腎臟上，剪取少量病變組織，放在研缽內(nèi)，加適量磷酸鹽緩沖液，充分研磨。取1滴研磨液在載玻片上，加蓋玻片，置顯微鏡下檢查，若見大量球蟲卵囊，判為球蟲感染。6綜合判定凡出現(xiàn)第3章的臨床癥狀和／或符合5.2的病變特征，可判為球蟲病疑似病例。凡符合5.2的病變特征，并滿足5.3和／或5.4中檢查結(jié)果為球蟲感染，或糞便定量檢查結(jié)果滿足或時，可判為球蟲病病例。4附錄A（規(guī)范性附錄）試劑及其配制A.1飽和鹽水配制食鹽，放入三角燒瓶中，加入1000水，加熱燒瓶至沸騰，充分攪拌后冷卻至室溫，有A.22.5%重鉻酸鉀溶液配制g重鉻酸鉀固體，放入1L燒杯中，加入開水至1000mL刻度處，重鉻酸鉀溶液。將下列試劑按次序加入到1000mL定量瓶中。蒸餾水800鹽酸(調(diào)溶液的值至7.4,再加蒸餾水定容至1L。分裝至或的玻璃瓶中在室溫保存。5附錄B（資料性附錄）球蟲卵囊形態(tài)特征B.1球蟲卵囊呈