SNT 1816-2013 轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 番茄檢測(cè)方法

中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)番茄檢測(cè)方法Detectionofgeneticallymodif2013-03-01發(fā)布2013-09-16實(shí)施I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草?！诔Ｒ?guī)PCR檢測(cè)方法中增加了被檢基因的啟動(dòng)子FMV35S;1本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了番茄及其制品中轉(zhuǎn)基因成分常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是不可少的，凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T19495.1轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)通用要求和定義GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求GB/T19495.3轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸提取純化方法SN/T1194植物及其產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)抽樣和制樣方法或?qū)崟r(shí)熒光PCR,檢測(cè)其中是否含有各種內(nèi)、外源基因，達(dá)到對(duì)番茄及其制品中有無(wú)轉(zhuǎn)基因成分的26.3試劑10×PCR緩沖液(氯化鉀100mmol/L、硫酸銨160mmol/L、硫酸鎂20mmol/L、Tris-HCl合附錄A中表A.1和表A.2的序列合成引物和探針，加超純水瓊脂糖(電泳純),溴化乙錠(EB),DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(100bp～2000bp),50×TAE電泳緩沖液酸275g/L、EDTA0.01mol/L、pH8.0),10×電泳上樣緩沖液(含0.25%溴酚藍(lán)、0.25%二甲苯青按照SN/T1194中規(guī)定的方法執(zhí)行。番茄種子或番茄葉片：經(jīng)干熱滅菌(150℃干熱預(yù)處理2h)或或粉碎機(jī)中碾磨至樣品粉末顆粒約0.5mm新鮮番茄：稱取20g果肉(汁)充分勻漿后備用，或者取出種子后冷凍研磨至樣品粉末顆粒約8.1樣品DNA的提取等體積的三氯甲烷/異戊醇(24:1),充分混勻，室溫15000g離心15min;小心吸取上清液(約600μL)至一新的1.5mL離心管，加入2.5倍體積的預(yù)冷的無(wú)水乙醇或0.8倍體積的異丙醇，再加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉(pH4.8),充分混勻，-20℃(加入無(wú)水乙醇時(shí))或4℃(加入異丙醇時(shí))放置330min以上；4℃,15000g離心15min,棄去上清液；加入70%的乙醇500μL,洗滌沉淀兩次，室溫15000g離心5min棄上清液(注意不要把沉淀倒出),晾干沉淀，至乙醇揮發(fā)殆盡后，采用市售的不同基因組DNA提取試劑盒提取番茄及其制品中的DNA,按操作說(shuō)明書(shū)使用。番茄檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)設(shè)置DNA提取空白對(duì)照、PCR擴(kuò)增試劑空白對(duì)常規(guī)PCR引物信息見(jiàn)表A.1,商品化轉(zhuǎn)基因番茄轉(zhuǎn)入的外源基因信息見(jiàn)表A.3。常規(guī)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)見(jiàn)表1和表2。10×PCR緩沖液引物DNA模板注：反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況或不同的反應(yīng)總體積進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。被檢測(cè)基因擴(kuò)增終延伸rbcL(內(nèi)源基因)PG(內(nèi)源基因)CaMV35S(外源基因的啟動(dòng)子)NOS(外源基因的終止子)FMV35S(外源基因的啟動(dòng)子)4使用番茄內(nèi)源基因(rbcL基因或PG基因)片段設(shè)計(jì)的引物對(duì)供試番茄樣品DNA提取液進(jìn)行PCR可進(jìn)行PCR測(cè)試的DNA,或DNA提取液中有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，應(yīng)該重新提取樣品DNA,直到擴(kuò)8.3.2.2外源基因檢測(cè)結(jié)果的判定白對(duì)照均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的條件下，如果陽(yáng)性對(duì)照和待測(cè)樣品均出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶(擴(kuò)增片段大如果測(cè)試樣品中未出現(xiàn)相應(yīng)PCR擴(kuò)增條帶，而陽(yáng)性對(duì)照正常，則可判定測(cè)試樣品8.3.2.3確證實(shí)驗(yàn)——PCR產(chǎn)物序列分析；——實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。8.4實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)8.4.1反應(yīng)體系實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)所用引物見(jiàn)表A.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表3。終濃度10×PCR緩沖液dNTP(含dUTP)引物(上游)引物(下游)DNA模板(20ng/μL～30ng/μL)注：反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況或不同的反應(yīng)總體積進(jìn)58.4.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)檢測(cè)內(nèi)源基因tRNA-Leu的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)為：37℃5min;預(yù)變性95℃3min;95℃15s,60℃1min,40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)內(nèi)源基因LAT52的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)為：50℃2min;預(yù)變性95℃10min;94℃30s,檢測(cè)外源基因NPTII、CaMV35S、NOS、FMV35S的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)參數(shù)為：37℃5min;預(yù)變性95℃3min;95℃15s,60℃1min,40個(gè)循環(huán)。8.4.3.1基線和閾值的設(shè)置測(cè)試樣品外源基因檢測(cè)Ct值在36>40之間，內(nèi)源基因檢測(cè)20≤Ct≤36,并出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，且8.4.4結(jié)果表述該樣品中未檢出×××基因。該樣品中檢出×××基因，或：該樣品是×××轉(zhuǎn)基因番茄品系。9樣品和數(shù)據(jù)保存根據(jù)樣品的狀態(tài)采用相應(yīng)的保存方式，一般保存期為6個(gè)月。如檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因成分，則該樣品應(yīng)保存1年左右，以備復(fù)驗(yàn)、談判和仲裁。樣品保存期滿后應(yīng)進(jìn)行妥善處理。測(cè)試樣品轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)結(jié)束后，應(yīng)將原始記錄單和檢驗(yàn)報(bào)告或證書(shū)歸檔，并妥善保管，以備復(fù)驗(yàn)、談判和仲裁。6被檢測(cè)基因引物序列退火溫度/℃葉綠體DNA提取效率檢測(cè)5'-ttcttcgcatgtacccgcag-3’內(nèi)源DNA提取效率檢測(cè)5'-cgttggtgcatccctgcatgg-3’5'-tcatcccttacgtcagtggag-3’篩選檢測(cè)(品系351N除外)選擇其一5'-ccatcattgcgataaaggaaa-3’5’-gctcctacaaatgccatca-3’5'-gatagtgggattgtgcgtca-3’5’-gaatcctgttgccggtcttg-3’篩選檢測(cè)(品系351N、8338和除外)選擇其一5'-ttatcctagtttgcgcgcta-3’5'-gccggtcttgcgatgattat-3’5'-ttatcctagtttgcgcgcta-3’5'-ggatctcctgtcatct-3’篩選檢測(cè)選擇其一5'-gatcatcctgatcgac-3’5'-ctcaccttgctcctccgaga-3’5'-cgccttgagcctggcggacag-3’5'-ccactgacgtaagggatgacg-3’383和180°5'-ggatccttagaagcatctagt-3’檢測(cè)B.Da.F5'-catcgcaagaccggcaacag-3’5'-aaacagacaaaaataggcgg-3’5'-ccaaacgtaaaacggcttg-3’5'-aagacatccaccgaacactta-3’5'-aggacagctcttttccacgtt-3’轉(zhuǎn)基因番茄可同時(shí)擴(kuò)增出383bp和180bp兩個(gè)不同大小的DNA片段，非轉(zhuǎn)基因番茄只能擴(kuò)被檢測(cè)基因引物序列5’標(biāo)記FAM;3'標(biāo)記TAMRA(除標(biāo)注以外)適用范圍任選其一5'-agaccacgagaacgatatttgc-3’5'HEX-ctcttgcagtcctcccttgggct-3’5’-cgacagtggtcccaaaga-3’5'-tggacccccacccacgaggagcatc-3’5'-aagacgtggttggaacgtcttc-3’篩選檢測(cè)5'-aggatctcgtcgtgacccat-3’篩選檢測(cè)5’-tggtecccacaagccagctgctcga-3’篩選檢測(cè)、5'-aggacagctcttttccacgtt-3’5'-gcaatcctgagccaaatcc-3’品系目的基因及其調(diào)控元件目的基因篩選基因食品和飼料，1995年用于種植。加拿大1995未知水解酶(Sam-K)未知1996年批準(zhǔn)用于食品、飼料和種植因CryIAc和氨基蛋白終1987Monsanto公司美國(guó)1998年用于食品、(ACCD)或乙烯形成酶(EFE)1994年批準(zhǔn)用于食品和飼料，1995年用于表A.3品系