GBT 28630.2-2012 白斑綜合征(WSD)診斷規(guī)程 第2部分套式PCR檢測(cè)法

第2部分：套式PCR檢測(cè)法I 第1部分：核酸探針斑點(diǎn)雜交檢測(cè)法 第3部分：原位雜交檢測(cè)法 本部分為GB/T28630的第2部分。GB/T28630.4—2012白斑綜合征(WSD)診斷規(guī)程第4部分：組織病理學(xué)診斷法24.1210μmol/L引物F1:5'-ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG-3',外側(cè)正向引物wSSVDNA的1447bp產(chǎn)物，-20℃保存。類動(dòng)物DNA中8481p的片段，-20℃保存類動(dòng)物DNA中84sbp的片毀4.27陽(yáng)性對(duì)照為已知受WSSV感染且PCR結(jié)果顯示明顯陽(yáng)性結(jié)果的wssyDNA模板，-20℃4.28陰性對(duì)照為已知未受wSSV感染且PCR結(jié)果顯示陰性結(jié)果的對(duì)蝦組織DNA模板，-20℃5.6手掌型離心機(jī)：用于PCR后區(qū)對(duì)0.2mLPCR管的離心，塑料轉(zhuǎn)頭，轉(zhuǎn)速2000r/min~350μL體系10×PCR緩沖液(無(wú)Mg2+)1×PCR緩沖液(無(wú)Mg2+)氯化鎂溶液(25mmol/L)TaqDNA聚合酶(5U/μL)100份反應(yīng)預(yù)混物總體積表2100份第二步PCR的反應(yīng)預(yù)混物所需試劑組成25pL體系10×PCR緩沖液(無(wú)Mg2+)1×PCR緩沖液(無(wú)Mg2+)氯化鎂溶液(25mmol/L)10pmol/L引物F24表2(續(xù))50μL體系TagDNA聚合酶(5U/μL)100份反應(yīng)預(yù)混物總體積注：25pL體系模板量2.56.2.4將上述待檢樣品放入滅菌1,m微離食重應(yīng)避免各樣品回的交叉房染，所有非一次性6.3.2在樣品剪碎后加入抽提緩沖液500pL,用研磨棒充分研磨37℃溫浴1h。6.3.8用70%乙醇洗滌沉淀2次，每次10000r/min離心5min,小心傾去上清，最后沉淀于室溫56.5.1第一步PCR6.6.1.2將凝膠液緩緩倒入設(shè)置好樣孔梳和防漏條/套的水平放置的凝膠船，膠液厚度0.6cm~6際測(cè)量的結(jié)果允許有1%～3%的誤差。問題排除十足類動(dòng)物樣品848bp處有條帶。被檢生物樣品照無(wú)任何條帶；帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)任何條帶。陽(yáng)性樣品第一步PCR后在1447bp處有條帶或第二步PCR后在941bp處有條帶。陰性樣品第一步PCR后在1477bp處無(wú)條帶且第二步PCR后在941bp處無(wú)條帶7表3(續(xù))結(jié)果判讀及原因分析問題排除陽(yáng)性對(duì)照有條帶，但Marker沒有影像以及PCR程序是否正確陰性對(duì)照組在1447bp或941bp處有條區(qū)的微量移液器跑電泳更換試劑禁止從PCR后區(qū)到PCR前區(qū)的交流，禁止從電泳區(qū)到PCR操作區(qū)物樣品中無(wú)任何條帶(包括無(wú)848bp條帶)DNA不純致使PCR抑制物用OD?so/OD?so比值來(lái)確定。其可見1447bp條帶，則記錄該樣品品出現(xiàn)較多雜帶或明顯的彌散區(qū)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增做好熱啟動(dòng)操作。樣品先要加或Mg2+濃度差異佳Mg2+離子濃度8表3(續(xù))問題排除中30min后再觀察結(jié)果重新制作瓊脂糖凝膠片電極顛倒或電泳時(shí)間過長(zhǎng)重新配置溴化乙錠(EB)溴化乙錠(EB)有毒，試劑的操作和廢棄物的處理按附錄B的規(guī)9試劑配方溶解后加入約42m袁鹽酸調(diào)口時(shí)接近3.0,冷卻至室溫，再用5mol/L鹽酸調(diào)整pH至8.0。99加熱至68℃助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH至7.2,加水定容至100mL。SDS微細(xì)晶粒易于擴(kuò)散，稱量時(shí)要戴面罩，稱量完畢后要清除殘留在稱量工作臺(tái)區(qū)和天平上蛋白酶KA.9酚-三氯甲烷-異戊醇(25:24:1)在500/mL永中加入室溫亡存置于聚丙烯塑料瓶酸電泳區(qū)。潔凈區(qū)和樣品區(qū)屬于PCR前區(qū)，擴(kuò)增區(qū)和電泳區(qū)屬于PCR后區(qū)。其中潔凈區(qū)專用于配制和觸任何PCR產(chǎn)物；擴(kuò)增區(qū)專用于進(jìn)行PCR循環(huán)和第二步PCR于PCR產(chǎn)物的檢測(cè)。只允許從潔凈區(qū)→樣品區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→電泳區(qū)的單向物流，同時(shí)PCR后區(qū)應(yīng)盡可B.2含PCR反應(yīng)產(chǎn)物的材料膠和手套等應(yīng)用3.0×10-3濃度的含氯消毒劑溶液處理后，再以塑料袋密封包裝后丟棄，含有PCR反應(yīng)產(chǎn)物的溶液應(yīng)加入含氯消毒劑達(dá)3.0×10-3的濃度，經(jīng)處理10min以上后方可直接倒入下水道口。只能密封保存在PCR后區(qū)。加入足量的水使溴化乙錠的濃度降低至0.5mg/mL以下。加入1倍體積的0.5mol/L高錳酸鉀，小心混勻后再加1倍體積的2.5mol/L鹽酸。小心混勻，于室溫放置數(shù)小時(shí)。加入1倍體積的每100mL溶液中加入100mg粉狀活性炭。于室溫放置1h,不時(shí)搖動(dòng)。用Whatmanl號(hào)濾紙過有強(qiáng)腐蝕性，操作時(shí)要穿戴實(shí)驗(yàn)服及手套。應(yīng)避免吸入或食入。直接的皮膚接觸應(yīng)立即用大量清B.5電泳電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生100V～600V的直流電壓，同時(shí)電極處會(huì)產(chǎn)生大量的微小氣泡。應(yīng)蓋好電泳槽上蓋以避免氣泡炸裂導(dǎo)致PCR產(chǎn)物的污染和有毒試劑的揮發(fā)。避免接觸電極及液面以防觸電。B.6紫外線(資料性附錄)白斑綜合征(WSD)套式PCR檢測(cè)產(chǎn)物序列121TCCCATACAAAGTCATCTTTCATGGACAACAT241ATGTCCCACAAGCAAAATTGTAACTGCCCC301GATAACGAGCATCTGGTATCCTCTTT421ATGTCCAAGATCGATTCTAGAGTAAC481ACTGA