自然選育和誘變育種

關于自然選育和誘變育種

第四章自然選育和誘變育種第2頁,共65頁，星期六，2024年，5月菌種選育經(jīng)驗育種定向育種自然選育誘變育種雜交育種分子育種主要通過突變和篩選來育種常規(guī)的雜交育種原生質體融合通過DNA重組技術來育種第3頁,共65頁，星期六，2024年，5月第一節(jié)自然選育自然選育：不經(jīng)人工處理，利用微生物的自然突變進行菌種選育的過程一、引起自然選育的因素1、低劑量的誘變效應2、互變異構效應第4頁,共65頁，星期六，2024年，5月基因突變第5頁,共65頁，星期六，2024年，5月

二、微生物突變的類型

1、

形態(tài)突變型2、致死突變型3、抗性突變型4、營養(yǎng)缺陷型突變型青霉第6頁,共65頁，星期六，2024年，5月三、微生物突變的特點1、

不對應性2、

自發(fā)性3、

稀有性4、

獨立性5、

誘變性6、

穩(wěn)定性7、可逆性第7頁,共65頁，星期六，2024年，5月稀釋法（四）、自然選育的程序1.采樣2.增殖培養(yǎng)3.純種分離4.生產(chǎn)性能的測定劃線法第8頁,共65頁，星期六，2024年，5月第二節(jié)、誘變育種

一

概念：誘變育種是利用各種誘變劑處理微生物細胞，提高基因突變頻率，再通過適當?shù)暮Y選方法獲得高產(chǎn)優(yōu)質菌種的育種方法。

第9頁,共65頁，星期六，2024年，5月二

誘變育種的原理基因突變:染色體畸變和點突變。染色體畸變：指的是染色體或DNA片段發(fā)生缺失、易位、逆位、重復等。點突變：指的是DNA中的堿基發(fā)生變化。

第10頁,共65頁，星期六，2024年，5月三、常用的誘變劑種類1、物理誘變劑：紫外線、快中子2、化學誘變劑：5—BU（5-溴尿嘧啶）硫酸二乙酯，亞硝基胍3、生物誘變劑：噬菌體第11頁,共65頁，星期六，2024年，5月3、使用方法：單一誘變劑處理:復合誘變劑處理：第12頁,共65頁，星期六，2024年，5月誘變育種中還常常采取誘變劑復合處理，使它們產(chǎn)生協(xié)同效應。第13頁,共65頁，星期六，2024年，5月

四、常用誘變劑的具體使用方法：

1、紫外線：第14頁,共65頁，星期六，2024年，5月A、誘變處理前，先開紫外燈預熱20分鐘，使光波穩(wěn)定。B、將3—5ml細胞懸浮液置于培養(yǎng)皿,于誘變箱內的電磁攪拌器上，照射3—5分鐘，進行表面殺菌。C、打開培養(yǎng)皿蓋，開啟電磁攪拌器，邊照射邊攪拌。D、處理一定時間后，在紅外燈下，吸取一定量菌液，經(jīng)稀釋后，取0.2毫升涂平板。第15頁,共65頁，星期六，2024年，5月2.5-溴尿嘧啶：A、稱取5-溴尿嘧啶，加入無菌生理鹽水微熱溶解，使?jié)舛葹?mg/ml。B、將細胞培養(yǎng)至對數(shù)期并重懸于緩沖液或生理鹽水中過夜。C、將5-溴尿嘧啶加入培養(yǎng)基內，一般為10—20微克/ml，倒平板。D、涂布菌液，在生長中誘變，挑單菌落進行測定。第16頁,共65頁，星期六，2024年，5月五、誘變育種的一般程序第17頁,共65頁，星期六，2024年，5月出發(fā)菌株

菌種純化同步培養(yǎng)制備單孢子懸浮液誘變劑處理

平板分離挑選疑似突變菌落純培養(yǎng)突變體的初步篩選

重復篩選選出突變體

第18頁,共65頁，星期六，2024年，5月1、同步培養(yǎng)誘變處理前，菌懸液的細胞應盡可能達到同步生長狀態(tài)，培養(yǎng)出生理活性一致的細胞。同步生長細胞的培養(yǎng)就及其收集第19頁,共65頁，星期六，2024年，5月第20頁,共65頁，星期六，2024年，5月2.孢子或菌體懸浮液的制備用生理鹽水或緩沖溶液配制，先用無菌的玻璃珠振蕩分開，再用脫脂棉過濾。第21頁,共65頁，星期六，2024年，5月3·變異菌株的初步篩選1）利用形態(tài)突變直接淘汰低產(chǎn)變異菌株。2）利用平皿反應直接挑取高產(chǎn)變異菌株。

第22頁,共65頁，星期六，2024年，5月飽浸含某種指示劑的固體培養(yǎng)基的濾紙片變色圈

指示劑直接摻入或噴灑固體培養(yǎng)基，菌落周圍形成變色圈。如淀粉的平皿上噴上稀碘液固體培養(yǎng)基中滲入溶解性差、可被特定菌利用的營養(yǎng)成分，造成不透明的培養(yǎng)基背景。菌落利用此物質形成透明圈。利用一些有特別營養(yǎng)要求的微生物作為工具菌，如待篩選菌具有該營養(yǎng)物的前體轉化成營養(yǎng)物能力，工具菌就能圍繞該菌生長待篩選的菌株能分泌產(chǎn)生某些能抑制工具菌生長的物質第23頁,共65頁，星期六，2024年，5月第三節(jié)營養(yǎng)缺陷型突變體的篩選及應用

一、營養(yǎng)缺陷型：指通過誘變而產(chǎn)生的喪失了合成某種營養(yǎng)物質的能力，必須在基本培養(yǎng)基中加入相應缺陷的物質才能正常生長的變異菌株。第24頁,共65頁，星期六，2024年，5月二、篩選營養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基[-]:凡是能滿足某種野生菌株營養(yǎng)要求最低成分的合成培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基:凡能滿足一切營養(yǎng)缺陷株營養(yǎng)需要的培養(yǎng)基[+]

。第25頁,共65頁，星期六，2024年，5月補充培養(yǎng)基[A]：只能滿足相應的營養(yǎng)缺陷型生長需要的組合培養(yǎng)基。第26頁,共65頁，星期六，2024年，5月三、營養(yǎng)缺陷型菌株篩選的一般方法

1.誘變處理2.淘汰野生型第27頁,共65頁，星期六，2024年，5月A、抗菌素法:

將抗生素加入到基本培養(yǎng)基中，殺死生長野生型菌株，濃縮營養(yǎng)缺陷型。用加有青霉素的基本培養(yǎng)基分離培養(yǎng)誘變處理后的菌體，野生型菌株因為繁殖產(chǎn)生的子細胞不能合成正常細胞壁而死亡，而對不能繁殖的營養(yǎng)缺陷型細胞因為在基本培養(yǎng)基中不能繁殖而得以保留。第28頁,共65頁，星期六，2024年，5月酵母菌：用加有制霉菌素基本培養(yǎng)基分離培養(yǎng)誘變處理后的菌體，制霉菌素抑制真菌細胞壁中甾醇合成，從而使繁殖中的細胞產(chǎn)生的子細胞死亡，保留營養(yǎng)缺陷型細胞。第29頁,共65頁，星期六，2024年，5月B、菌絲過濾法:

誘變后的孢子在[—]中培養(yǎng)一段時間后過濾，去除大部分野生型菌株，濃縮營養(yǎng)缺陷型。Sartorius正壓式過濾器真菌和放線菌等絲狀菌的野生型菌株在基本培養(yǎng)基中產(chǎn)生菌絲體，而營養(yǎng)缺陷型菌株以孢子形式存在，不能萌發(fā)。把誘變處理后的孢子懸液用液體基本培養(yǎng)基培養(yǎng)，適溫振蕩培養(yǎng)，使野生型孢子萌發(fā)形成菌絲體，用滅菌脫脂棉、濾紙等除去菌絲體，再培養(yǎng)，再過濾。重復3～4次，最大限度地除去野生型菌株，然后再分離第30頁,共65頁，星期六，2024年，5月三、檢出所需缺陷型

逐個檢出法

經(jīng)誘變處理后的細胞涂布在平板上，待長出單個菌落后，用接種針將這些單個菌落逐個依次地分別接種到基本培養(yǎng)基和另一完全培養(yǎng)基。經(jīng)培養(yǎng)后，如果在完全培養(yǎng)基上的某一部位上出現(xiàn)菌落，而在基本培養(yǎng)基上卻不長菌，說明這是一個營養(yǎng)缺陷型。第31頁,共65頁，星期六，2024年，5月三、檢出所需缺陷型

影印培養(yǎng)法

將長出菌落的平皿開口朝下，在絲絨布上輕輕地印一下，把此皿上的全部菌落轉印到另一基本培養(yǎng)基平板上。經(jīng)培養(yǎng)后，比較這兩個平皿上長出的菌落，如果發(fā)現(xiàn)前一平皿上某一部位長有菌落，而在后一培養(yǎng)基的相應部位上卻沒有，說明這就是一個營養(yǎng)缺陷型。第32頁,共65頁，星期六，2024年，5月第33頁,共65頁，星期六，2024年，5月一般從菌落大小也可以判斷，新長出的菌落較小，即是營養(yǎng)缺陷型夾層培養(yǎng)法

A、夾層培養(yǎng)法:先在培養(yǎng)皿中倒一薄層不含菌的基本培養(yǎng)基，待冷凝后加上一層含誘變處理菌液的基本培養(yǎng)基，其上再澆一薄層不含菌的基本培養(yǎng)基。經(jīng)培養(yǎng)后在培養(yǎng)皿底用筆對首次出現(xiàn)的菌落作記號，然后再在其上倒一薄層完全培養(yǎng)基。再經(jīng)培養(yǎng)后所出現(xiàn)的新菌落，多數(shù)為營養(yǎng)缺陷型。第34頁,共65頁，星期六，2024年，5月

四.鑒定營養(yǎng)缺陷型生長譜法第35頁,共65頁，星期六，2024年，5月方法一：把純化好的缺陷型菌株與基本培養(yǎng)基倒混合平板或涂布平板，再在平板上點接各種營養(yǎng)物質（最好稀釋成一定濃度，用濾紙片法接入），適溫培養(yǎng)，觀察生長圈。此法可以在一個平板上對一株菌進行多種營養(yǎng)因子進行測定方法二：在基本培養(yǎng)基中加入某種營養(yǎng)物質，倒混合平板，再點接菌株，觀察生長圈。此法可同時對多個菌株進行測定第36頁,共65頁，星期六，2024年，5月第37頁,共65頁，星期六，2024年，5月五、

營養(yǎng)缺陷型突變株的應用1.工業(yè)微生物育種中，用于積累代謝中間產(chǎn)物2.作為雜交、重組育種的遺傳標記3.用于微生物代謝途徑研究4.在轉化、轉導、原生質體融合、質粒和轉座子研究中用作標記菌株第38頁,共65頁，星期六，2024年，5月營養(yǎng)缺陷型的應用實例

利用營養(yǎng)缺陷型突變株來生產(chǎn)氨基酸和核苷酸是典型的例子

第39頁,共65頁，星期六，2024年，5月天冬氨酸激酶(AK)被賴氨酸及蘇氨酸協(xié)同反饋所抑制通過誘變處理，獲得高絲氨酸缺陷型突變菌株，該突變型不能產(chǎn)生蘇氨酸。在限量高絲氨酸的培養(yǎng)基中缺陷型菌株能夠正常生長，并且因為消除了反饋抑制突變型能過量生產(chǎn)L-賴氨酸

第40頁,共65頁，星期六，2024年，5月第四節(jié)

溫度敏感突變株的篩選

一、溫度敏感突變株（temperature-sensitivemutant,TS突變體）：

突變株在一定溫度范圍內（許可溫度）正常生長，其表型和野生型沒有區(qū)別，但超出這一溫度范圍（非許可溫度），則不能生長或生長微弱甚至死亡（條件致死）或某些代謝停止或減弱。

第41頁,共65頁，星期六，2024年，5月二、TS突變的原理TS突變主要是由必需基因發(fā)生突變，致使該基因在一定溫度條件下無法正常表達，或其編碼的酶失活，造成細胞不能正常生長。第42頁,共65頁，星期六，2024年，5月三、TS突變株的選育方法（一）TS突變株的誘發(fā)

TS突變主要由基因錯義突變所致，要選擇易于引起堿基置換的亞硝基類、磺酸酯類化合物，或亞硝酸、UV等誘變劑。（二）

淘汰野生型菌株/TS菌株富集培養(yǎng)抗生素法：加入抗生素，在非許可溫度下培養(yǎng)一定時間，殺滅在該溫度下生長的野生型菌株，再離心除去抗生素，分離

第43頁,共65頁，星期六，2024年，5月四、TS突變株分離篩選

富集培養(yǎng)后，用完全培養(yǎng)基先在許可溫度下培養(yǎng)，再用影印法、點植法等方法在許可溫度和非許可溫度下分別培養(yǎng)，對照結果即可檢出TS突變體；也可同一平板先在非許可溫度培養(yǎng)，長出野生型菌株，做好記號，再轉許可溫度培養(yǎng)，則后長出的為TS菌株。第44頁,共65頁，星期六，2024年，5月五、TS突變株在發(fā)酵工業(yè)中應用1、

在谷氨酸發(fā)酵中的應用增加谷氨酸產(chǎn)量的關鍵在于改變菌體的細胞膜結構和功能，通過一些有效方法使谷氨酸產(chǎn)生菌由谷氨酸非積累型轉變?yōu)榉e累型。如：以乳糖發(fā)酵桿菌NO2256為出發(fā)菌株，選育出細胞膜結構或功能缺損的TS突變株88號，通過溫度來調節(jié)細胞膜透性。當在許可溫度(30℃)下培養(yǎng)繁殖得到一定量菌體后，升溫致非許可溫度(37℃)培養(yǎng)，使細胞膜的合成、結構或功能發(fā)生障礙，結果突變株能在高濃度生物素培養(yǎng)基中分泌大量谷氨酸。第45頁,共65頁，星期六，2024年，5月2、TS突變株在絲氨酸發(fā)酵中的應用以C1化合物為唯一碳源的微生物合成細胞組分是通過絲氨酸途徑來實現(xiàn)的。要提高絲氨酸產(chǎn)量，關鍵在于阻斷絲氨酸降解。日本味之素公司的Moringga篩選到TS突變株，它們在30℃絲氨酸降解正常，但在38～40℃失去降解絲氨酸的能力，因而大量分泌絲氨酸第46頁,共65頁，星期六，2024年，5月第五節(jié)

誘變育種實例第47頁,共65頁，星期六，2024年，5月一、

產(chǎn)環(huán)己酰亞胺新菌株YIM41004的復合誘變選育

前言：環(huán)己酰亞胺（cycloheximide）,又名放線酮（Actidione），是于1948年德國化學家B.E.Leach等分離并鑒定出來的一種戊二酰類化合物.它對多種真菌具有拮抗作用，其制劑具有水溶解性良好、作用劑量低的優(yōu)點,在植物保護方面得到廣泛應用。云南大學省微生物研究所教育部微生物資源重點實驗室）發(fā)現(xiàn)一株產(chǎn)生具有產(chǎn)生環(huán)己酰亞胺類化合物的放線菌新種Streptomycesyunnanensis,典型菌株為YIM41004第48頁,共65頁，星期六，2024年，5月（一）

產(chǎn)環(huán)己酰亞胺新菌株YIM41004的復合誘變選育

為了選育出活性物質產(chǎn)量高、遺傳性狀穩(wěn)定、培養(yǎng)要求低、工藝簡單的優(yōu)良菌株,作者采用紫外線（UV）、亞硝基胍（NTG）、UV+LiCl和60Co對YIM41004進行了復合誘變研究。經(jīng)過八代誘變育種，到一株生產(chǎn)特性和生長特性均有所改善的變異菌株F8-439.第49頁,共65頁，星期六，2024年，5月（二）孢子懸液預培養(yǎng)

用種子培養(yǎng)基刮洗下5~7d成熟斜面孢子，并稀釋到1千萬至1億個孢子每毫升，置于50mL帶玻璃珠和攪拌子的三角瓶中，28℃磁力攪拌培養(yǎng)到大多數(shù)孢子開始萌發(fā)（約3~4h).60Co誘變時不做預培養(yǎng).

第50頁,共65頁，星期六，2024年，5月（三）

誘變處理方法1UV誘變一切操作在紅光下或避光進行.取經(jīng)預培養(yǎng)的孢子懸液8mL于直徑9cm帶攪拌子平皿中，在誘變箱中(提前開紫外燈0.5h)磁力攪拌，15W30cm照射一定時間.收集于試管中，冰水浴2h，鈍化修復酶.涂布基礎培養(yǎng)基分離平板，28℃避光培養(yǎng)2~3d.第51頁,共65頁，星期六，2024年，5月2、

亞硝基胍（NTG）誘變于通風櫥中準確稱量NTG，加助溶劑甲酰胺或丙酮少許（1~2mL）,用pH6.0磷酸緩沖液溶解成1mg·mL-1，保存于棕色瓶中.NTG不用滅菌，現(xiàn)配現(xiàn)用.采用混合平板涂菌法：先倒好含5~25μg·mL-1NAG的混合平板,再用預培養(yǎng)好的孢子懸液涂布分離平板，28℃避光培養(yǎng)3~4d.第52頁,共65頁，星期六，2024年，5月360Co誘變每支試管中裝3mL用生理鹽水稀釋到106~107孢子/mL的孢子懸液，整個過程置于裝有冰水的燒杯中，照射劑量以處理總劑量計算.第53頁,共65頁，星期六，2024年，5月

4UV+LiCl復合誘變孢子懸液按UV誘變常規(guī)處理后涂布于含0.1~1.0%LiCl(W/V)的分離平板上，28℃培養(yǎng)3~4d.第54頁,共65頁，星期六，2024年，5月（三）

篩選步驟1－預篩1瓊脂塊法預篩瓊脂塊制備:在直徑9cm平皿中定量加入30mL基礎培養(yǎng)基,冷卻凝固后用直徑6mm打孔器打好瓊脂塊，然后用竹簽把瓊脂塊移至直徑9cm空平皿中

單菌落點接瓊脂塊和培養(yǎng):挑?、裥途洌蛐螒B(tài)變異明顯的菌落，點接到瓊脂塊上.每次誘變最少挑200株.把以上平皿置于保濕盒內，28℃培養(yǎng)2d，使活性物質積累于瓊脂塊中;

瓊脂塊生測:把培養(yǎng)好的瓊脂塊移到生測平板上，28℃培養(yǎng)2d,測量抑菌圈直徑.每生測平板挑取抑菌圈最大的菌落2~3個，接種斜面,每次誘變最少挑50株.第55頁,共65頁，星期六，2024年，5月（三）

篩選步驟2小瓶發(fā)酵初篩預篩所得菌株斜面培養(yǎng)5~7d，待孢子成熟，刮取約1/4斜面孢子，接種于裝有20mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，200r/min，28℃培養(yǎng)96h.發(fā)酵液4000r/min離心10min，取40μL上清液用杯碟法生測初篩出抑菌圈最大的20株用于復篩和菌種保藏.第56頁,共65頁，星期六，2024年，5月（三）

篩選步驟3－復篩3大瓶復發(fā)酵復篩用初篩出的5~8株菌成熟斜面孢子接種于裝有100mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶，200r/min，28℃培養(yǎng)48h，得種子液.取種子液10mL接種于裝有80mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，200r/min，28℃培養(yǎng)96h.復發(fā)酵復篩3批次，每次每株重復接種3瓶.發(fā)酵液用HPLC法測定發(fā)酵液放線酮含量，篩選出2~4株產(chǎn)量高的變異菌株用于下一輪誘變處理和菌種保藏.第57頁,共65頁，星期六，2024年，5月（四）

測定方法1

1指示菌平板生物活性測定法（生測）指示菌：用放線酮敏感菌株赭色擲孢酵母菌（Sporolomycessalmonicolor）.

生測平板制備：用直徑20cm平皿.下層：水瓊脂100mL（含2﹪瓊脂）；上層：取新鮮酵母菌斜面1支，用5mL生理鹽水刮洗下菌體，倒入已熔化并冷卻到45~50℃的80mL指示菌培養(yǎng)基中，搖勻，迅速倒入平皿中.冷卻后用于生測，現(xiàn)制現(xiàn)用.第58頁,共65頁，星期六，2024年，5月（四）

測定方法22HPLC法復篩時菌株發(fā)酵液用濃硫酸調酸至pH2~3，搖勻后靜置30min,4000r/min離心10min.上清液用2倍體積氯仿萃取2次，有機相合并蒸干，甲醇洗脫并定容，用HPLC法測定放線酮含量.含量根據(jù)色譜峰面積與標準品的峰面積對比進行計算.第59頁,共65頁，星期六，2024年，5月（五）

誘變劑量的確定

為確定各誘變劑合適的處理劑量，每一種誘變劑設置了一系列不同的處理劑量，對孢子懸液按誘變處理操作進行處理，平板分離后統(tǒng)計致死率。由于實驗菌株YIM41004為初次受誘變，本實驗擬選擇致死率在90％~99％的高致死率來確定各誘變劑合適的處理劑量.根據(jù)實驗結果，擬定各誘變劑合適的處理劑量為：UV誘變時UV照射時間選40s~60s，NTG誘變時選分離平板培養(yǎng)基中加15μg·mL-1NTG，60Co誘變時選照射總劑量為1.0×105R，UV+LiCl復合處理時選UV照射時間40~50s、分離平板培養(yǎng)基中加0.1％LiCl(w/w).第60頁,共65頁，星期六，2024年，5月（六）YIM41004菌落形態(tài)篩選

誘變處理前對出發(fā)菌株YIM410