食源性致病菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序

食源性致病菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序

福建省疾病預(yù)防控制中心

二O一二年H-一月

生物樣本檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序

(-)糞便樣本的保存、運(yùn)送和檢測(cè)

表1糞便樣本的保存、運(yùn)送和檢測(cè)培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基目標(biāo)病原體溫度

細(xì)菌標(biāo)本保

方工LCary-Blair所有食源性致病菌室溫

存和遷送

增菌液1.改良磷酸鹽緩沖液小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌4℃

2.mEC增菌肉湯EHECO157:H7/STEC37℃

3.Preston肉湯彎曲菌微需氧42℃

4.SBG增菌液沙門(mén)氏菌37℃

5.3%氯化鈉堿性蛋白膿水弧菌37℃

選擇性分離1.Mac平板EPEC、STEC、ETEC、EIEC、37℃

平板EAEC、志賀氏菌

2.XLD平板志賀氏菌37℃

3.mCCD平板彎曲菌微需氧42℃

4-耶爾森氏菌選擇性平板小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌25℃

5.科瑪嘉O157:H7顯色平板EHECO157:H737℃

6.科瑪嘉沙門(mén)氏菌顯色平板沙門(mén)氏菌37℃

7.科瑪嘉弧菌顯色平板弧菌37℃

TCBS平板

病毒標(biāo)本1.采便盒輪狀病毒、諾如病毒、札如-20℃以下

病毒、星狀病毒、腺病毒

（二）檢驗(yàn)方法與流程

3

(三)沙門(mén)氏菌和志賀氏菌檢測(cè)操作程序

1范圍

本程序規(guī)定了糞便標(biāo)本中沙門(mén)氏菌(Sabnondla)和志賀氏菌(Shigella)的檢驗(yàn)方法。

2檢驗(yàn)程序

沙門(mén)氏菌和志賀氏菌檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1。

糞便或肛拭子

直接

SBG增菌液

36℃±1℃,18h~24h

XLD和MAC科瑪嘉沙門(mén)顯色培養(yǎng)基

36℃,18h-24h

挑取3個(gè)或以上可疑菌落，接種于5%羊血瓊脂平板

36℃±1℃,18h-24h

TSI,賴氨酸，MIO,西蒙氏檸檬酸鹽瓊脂，尿素

36℃±1℃,18h?24h

11i

TSI:K/Ag++TSI:K/AtrTSI:K/AgTSI:K/ATSI:K/A反應(yīng)結(jié)果與

賴氨酸:+賴氨酸:+賴氨酸:-賴氨酸:-賴氨酸:-左側(cè)描述不

MIO:+/?/+MIO:+/-/-MIO:+/?/+MIO:-/-/+符

檸檬酸鹽:+檸檬酸鹽:-檸檬酸鹽:-檸檬酸鹽:-檸檬酸鹽:-

尿素:-尿素:-尿素:-尿素:-尿素:-

可能是腸道

III菌群，或者需

沙門(mén)氏菌屬傷寒沙門(mén)氏甲型副傷寒志賀氏菌屬宋內(nèi)志賀氏要額外試驗(yàn)

菌沙門(mén)氏菌菌以排除其他

致病菌或生

化不典型的

沙門(mén)氏菌或

志賀氏菌分

進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定、血清學(xué)試驗(yàn)

離株

報(bào)告

圖1沙門(mén)氏菌和志賀氏菌檢驗(yàn)程序

4

3操作步驟

3.1標(biāo)本收集

標(biāo)本包括新鮮的或轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便或肛拭子。最優(yōu)標(biāo)本是轉(zhuǎn)移至

Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便拭子。肛拭子不是最佳標(biāo)本，僅在病人無(wú)糞便標(biāo)本時(shí)采用。肛

拭子收集后應(yīng)當(dāng)目測(cè)，需要在拭子上明顯見(jiàn)到糞便。

所采集的標(biāo)本盡快檢驗(yàn)，放入Ca^-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基中的標(biāo)本應(yīng)在冷藏條件下24h內(nèi)

送檢。新鮮的糞便標(biāo)本置于清潔、干燥、無(wú)肥皂或消毒液殘留的容器中，冷藏條件下8h

內(nèi)送檢。

3.2分離培養(yǎng)

3.2.1直接分離培養(yǎng)

新鮮糞便：無(wú)菌拭子采集少量糞便，盡量從可見(jiàn)血或黏液的部位收集；新鮮拭子在XLD

和MAC一區(qū)劃線；以1pL無(wú)菌接種環(huán)或接種針劃線分離。在標(biāo)本中再插入一個(gè)清潔的無(wú)

菌拭子，將拭子放入SBG增菌液。輕擰管蓋。注意：拭子表面有?層標(biāo)本即可，不可將過(guò)

量的標(biāo)本放入SBG增菌液。

肛拭子：操作程序同新鮮糞便。

轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便拭子：輕攪混合標(biāo)本；拭子在XLD和MAC一區(qū)

劃線；以1UL無(wú)菌接種環(huán)或接種針劃線分離；在標(biāo)本中再插入一個(gè)清潔的無(wú)菌拭子，將拭

子放入SBG增菌液。輕擰管蓋。注意：拭子表面有一層標(biāo)本即可，不可將過(guò)量的標(biāo)本放入

SBG增菌液。

平板36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h?

3.2.2增菌培養(yǎng)

增菌液于36℃±1°C培養(yǎng)18h-24h,采用上述方法于科瑪嘉沙門(mén)氏菌顯色平板上劃線

分離，36℃±1℃培養(yǎng)18h?24h。

3.3菌落特征

3.3.1選擇性平板上可疑菌落的特征見(jiàn)表1。

表1沙門(mén)氏菌屬和志賀氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征

選擇性瓊沙門(mén)氏菌傷寒沙門(mén)氏菌志賀氏菌屬

脂平板（大多數(shù)）

MAC瓊脂菌落光滑、無(wú)色，直

徑2mm?3mm

XLD瓊脂菌落呈紅色，直徑2

mm?4mm

科瑪嘉顯紫色或酒紅色紫色或酒紅色

色培養(yǎng)基

3.4純培養(yǎng)

挑取3個(gè)或以上可疑菌落，劃線接種5%羊血瓊脂平板，36℃士1℃培養(yǎng)18h?24h。

3.5初步鑒定

可疑菌落接種TSI瓊脂，賴氨酸脫竣酶培養(yǎng)基、動(dòng)力-靛基質(zhì)-鳥(niǎo)氨酸瓊脂（MIO）、西

蒙氏檸檬酸鹽瓊脂和尿素瓊脂。沙門(mén)氏菌屬和志賀氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別見(jiàn)表2,

5

表2沙門(mén)氏菌屬和志賀氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表

項(xiàng)目沙門(mén)氏傷寒甲型副傷寒志賀氏菌屬

（大多數(shù)）沙門(mén)氏菌沙門(mén)氏菌

TSI（斜面）KKKK

TSI（底層）AAAA

TSI（產(chǎn)氣）+一++

TSI（硫化氫）+少量——

賴氨酸++———

MIO（動(dòng)力）+++——

MIO（靛基質(zhì)）————可變

MIO（鳥(niǎo)氨酸）+++痢疾志賀氏菌、福氏志賀

氏菌、鮑氏志賀氏菌：一

宋內(nèi)志賀氏菌：+

檸檬酸鹽（西蒙氏）+一一—

尿素———————

3.6血清學(xué)鑒定

挑取5%羊血瓊脂平板上的菌落，進(jìn)行沙門(mén)氏菌和志賀氏菌的血清學(xué)鑒定，設(shè)鹽水對(duì)照。

3.7確定鑒定

刮取5%羊血瓊脂平板上的單個(gè)菌落，進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定。

4結(jié)果與報(bào)告

報(bào)告糞便標(biāo)本中檢出沙門(mén)氏菌或志賀氏菌。

5菌株的保存和上送

培養(yǎng)物穿刺接種半固體培養(yǎng)基，輕擰管蓋，36℃±1℃培養(yǎng)24h,蓋緊管蓋。如果需

要長(zhǎng)期保存菌株，將0.7mL腦心浸液肉湯6h?12h培養(yǎng)物和0.3mL滅菌甘油加入滅菌菌

種管，立即放置一70°C保存。按照方案要求定期上送。

6

（四）致瀉大腸埃希氏菌檢測(cè)操作程序

1范圍

本程序規(guī)定了糞便標(biāo)本中致瀉大腸埃希氏菌（DiarrheagenicEscherichiacoli）的檢驗(yàn)方

法。

2操作步驟

2.1標(biāo)本收集

標(biāo)本包括新鮮的或轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便或肛拭子。最優(yōu)標(biāo)本是轉(zhuǎn)移至

Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便拭子。肛拭子不是最佳標(biāo)本，僅在病人無(wú)糞便標(biāo)本時(shí)采用。肛

拭子收集后應(yīng)當(dāng)目測(cè)，需要在拭子上明顯見(jiàn)到糞便。

所采集的標(biāo)本盡快檢驗(yàn)，放入Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基中的標(biāo)本應(yīng)在冷藏條件下24h內(nèi)

送檢。新鮮的糞便標(biāo)本置于清潔、干燥、無(wú)肥皂或消毒液殘留的容器中，冷藏條件下8h

內(nèi)送檢。

2.2直接分離培養(yǎng)

新鮮糞便：無(wú)菌拭子采集少量糞便，盡量從可見(jiàn)血或黏液的部位收集；新鮮拭子在MAC

一區(qū)劃線；以1pL無(wú)菌接種環(huán)或接種針劃線分離。

肛拭子：操作程序同新鮮糞便。

轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便拭子：輕攪混合標(biāo)本；拭子在MAC一區(qū)劃線；以

1NL無(wú)菌接種環(huán)或接種針劃線分離。

平板36℃±1℃培養(yǎng)18h?24h。

2.3菌落特征

挑取5個(gè)可疑大腸埃希氏菌菌落（粉紅色、突起、光滑、濕潤(rùn)）直接保存半固體菌種

管；采用PCR檢測(cè)特異毒力基因方法鑒別5種致瀉大腸埃希氏菌。

3多重PCR鑒定

3.1標(biāo)準(zhǔn)菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株一覽表見(jiàn)表3。

表3標(biāo)準(zhǔn)菌株一覽表

菌株名稱標(biāo)準(zhǔn)號(hào)來(lái)源

EPECCMCC44155中國(guó)食品藥品檢定研究院

STEC具有stxlstx2毒力基因中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病所

ETECCMCC44815中國(guó)食品藥品檢定研究院

EIECCMCC44825中國(guó)食品藥品檢定研究院

EAEC042血清型中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病所

大腸埃希氏菌ATCC25922WHO

3.2引物合成

多重PCR引物序列見(jiàn)表4。

7

表4五種致瀉大腸埃希氏菌目的基因引物序列

片段大小

目標(biāo)菌目標(biāo)基因引物序列

(bp)

EPEC、STECescV-F5r-ATTCTGGCTCTCTTCTTCTTTATGGCTG3544

escLR5X-CGTCCCCTTTTACAAACTTCATCGC3

EPECbfpB-￥5f-GACACCTCATTGCTGAAGTCG3910

hJpB-R5X-CCAGAACACCTCCGTTATGC3

STECstxlA-F5，-CGATGTTACGGTTTGTTACTGTGACAGC-3'244

stxlA-R5r-AATGCCACGCTTCCCAGAATTG3

stx2A-F55TTTGACCATCTTCGTCTGATTATTGAGS324

stx2A-R5，?AGCGTAAGGCTTCTGCTGTGAC3

ETECElt-Y5r-GAACAGGAGGTTTCTGCGTTAGGTG-3'655

Elt-R5,CTTTCAATGGCTTTTTTTTGGGAGTC_3'

estla-F5f-CCTCTTTTAGYCAGACARCTGAATCASTTG3157

estla-R5，-CAGGCAGGATTACAACAAAGTTCACAG-3'

estlh-F5，-TGTCTTTTTCACCTTTCGCTC-3'171

estlb-R5f-CGGTACAAGCAGGATTACAACACS

EIECinvE-F5，?CGATCAAGAATCCCTAACAGAAGAATCAC3766

invE-R5，-CGATAGATGGCGAGAAATTATATCCCG-3'

EAECastA-F5<TGCCATCAACACAGTATATCCG3102

astA-R5，-ACGGCTTTGTAGTCCTTCCAT-3'

aggR-F5r-ACGCAGAGTTGCCTGATAAAG3400

aggR-R5r-AATACAGAATCGTCAGCATCAGC-3'

Pic-F5，-AAATGTCAGTGAACCGACGATTGG-3'1111

Pic-R5，?AGCCGTTTCCGCAGAAGCC3

通用uidA-F5'-AAAGTGTGGGTCAATAATCAGGAAGTG-3'1487

uidA-R5<ATGCCAGTCCAGCGTTTTTGC-3;

3.3標(biāo)本處理

刮取營(yíng)養(yǎng)平板上的過(guò)夜新鮮培養(yǎng)物1環(huán)?2環(huán)，至裝有1mL0.85%滅菌生理鹽水的

Eppendorf管內(nèi)，混勻。4℃~8℃,12000r/min離心15min,棄去上清。沉淀加入IOOJAL

滅菌去離子水中，混勻。100°C煮沸12min,12000r/min離心5min,上清即為PCR擴(kuò)增

模板，可直接用于PCR反應(yīng)。

3.4多重PCR

五種致瀉大腸埃希氏菌目的基因多重PCR擴(kuò)增加樣體系見(jiàn)表5。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變

性94℃5min。變性94℃30s,復(fù)性63℃30s,延伸72℃1.5min,30個(gè)循環(huán)。最

后720c延伸5min。

8

表5五種致瀉大腸埃希氏菌目的基因多重PCR擴(kuò)增加樣體系

試劑加樣體積(gL)

dH2O8.3

lOxPCRBuffer2.5

25mMMgCl22.5

2.5mMdNTPs3.0

25pMescV-F0.4

25pMescV-R0.4

25gMb加B-F0.1

25gM0.1

25pMstxlA-F0.2

25pMstxlA-R0.2

25pMsfx2A-F0.4

25pMstx2A-R0.4

25gMelt—F0.1

25gMelt-R0.1

25pMestla-F0.4

25pMestla—R0.4

25pMestlb-F0.2

25pMesilb-R0.2

25gMmvE-F0.2

25gMZHVE-R0.2

25pMasfA-F0.4

25pM4sS-R0.4

25pMaggR—F0.2

25pMaggR-R0.2

25pMpic-F0.2

25jiMpic-R0.2

25pMuidA-F0.2

25gMuidA-R0.2

3U/pLTaq酶0.7

DNA模板2.0

3.5檢測(cè)結(jié)果的判定

取5pLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳。根據(jù)特異性核酸條帶大小和數(shù)目判斷

致瀉大腸埃希氏菌的種類。見(jiàn)圖2。

9

圖2種致瀉大腸埃希氏菌目的基因多重PCR擴(kuò)增片段

注：圖中標(biāo)示EPEC、EHEC(STEC)、ETECsEIEC、EAEC的泳道為反應(yīng)體系中僅存在

相應(yīng)的一種模板和12對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增后出現(xiàn)的片段，而MIX泳道為將五種致瀉大腸埃希

氏菌混合后與12對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增后出現(xiàn)的片段。

4血清學(xué)鑒定

4.1挑取PCR擴(kuò)增陽(yáng)性菌種，營(yíng)養(yǎng)平板分離，36℃±1℃培養(yǎng)過(guò)夜。

4.2根據(jù)PCR鑒定結(jié)果，用相應(yīng)致病大腸血清0多價(jià)、單價(jià)、K、H診斷血清進(jìn)行血清玻

片凝集試驗(yàn)進(jìn)行診斷。見(jiàn)表6。

表6常見(jiàn)致瀉大腸埃希氏菌的0血清群及血清型

嬰幼兒腹瀉成人和兒童腹瀉

EPECETECEIECSTECEAEC

。20026O44C)6：Ki5：H[608《0田9C)28aC。即出O,Kgg

°55。86O111。8：區(qū)5刊9OS：H47：H-。［12。26：&2：曰1Oioi：K99

0||401190125O11-H27O|240111

012601270128O20：H-O25:K7:H42O1360103

C)25：K98：H()27：H7O|430145

0142。158

C)27：H20C)63：H12。1440104

。73出45C)78：H]i0152

C)78：H]2。85：%O|64

I>

OII4：H21O1I5：[H51]

Oi27：Hi20128.Hy

0I28：H21O139-H28

。148出28。149丑4

。159出4Oi59：H20

。159：%40166^27

OI69:H-

注：1：無(wú)動(dòng)力的變異

4.3報(bào)告血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5生化鑒定

10

5.1對(duì)PCR陽(yáng)性、血清學(xué)可分型及不可分型菌株進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定。

5.2報(bào)告最終鑒定結(jié)果。

6菌株保存和上送

4℃或室溫保存的半固體培養(yǎng)基保菌菌種至少2套（穿刺接種后36°C培養(yǎng)過(guò)夜即可）

或30%甘油肉湯凍存管-70"C保存菌株至少2套。按照要求定期上送。

II

(五)大腸埃希氏菌O157:H7檢測(cè)操作程序

1范圍

本程序規(guī)定了糞便標(biāo)本中大腸埃希氏菌O157:H7(EscherichiacoliO157:H7)的檢驗(yàn)方

法。

2檢驗(yàn)程序

大腸埃希氏菌0157:H7檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖3。

糞便或肛拭子

mEC肉湯

36℃±1℃,9h-12h

膠體金試紙篩檢陽(yáng)性

免疫磁珠捕獲

CT-SMAC和改良科瑪嘉0157：H7顯色平板

^36℃±1℃,16h~20h

挑取10~20個(gè)可疑菌落，接種KIA、MIU

36℃±1℃,16h~20h

革蘭氏染色生化鑒定血清學(xué)鑒定毒力因子鑒定

靛基質(zhì)(+)0157多價(jià)(+++)溶血素基因

甲基紅(+)0157單價(jià)(+++)志賀毒素基因

V-P(-)H7多價(jià)(+++)eae基因等

檸檬酸鹽(-)

報(bào)告

圖3大腸埃希氏菌O157:H7檢驗(yàn)程序

3操作步驟

3.1標(biāo)本收集

12

標(biāo)本包括新鮮的或轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便或肛拭子。最優(yōu)標(biāo)本是轉(zhuǎn)移至

Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便拭子。肛拭子不是最佳標(biāo)本，僅在病人無(wú)糞便標(biāo)本時(shí)采用。肛

拭子收集后應(yīng)當(dāng)目測(cè)，需要在拭子上明顯見(jiàn)到糞便。

所采集的標(biāo)本盡快檢驗(yàn)，放入Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基中的標(biāo)本應(yīng)在冷藏條件F24h內(nèi)

送檢。新鮮的糞便標(biāo)本置于清潔、干燥、無(wú)肥皂或消毒液殘留的容器中，冷藏條件下8h

內(nèi)送檢。

3.2增菌培養(yǎng)

增菌液采用添加20mg/L新生霉素的改良EC肉湯（mEC）。將采集的一支便拭子1:10

接種于6mLmEC肉湯，36℃±1℃恒溫?fù)u床增菌培養(yǎng)6h（如無(wú)搖床，36℃±1°C恒溫增

菌培養(yǎng)9h?12h）。

3.3大腸埃希氏菌O157:H7膠體金試紙快速篩查

3.3.1將膠體金試紙從袋中取出，平放于潔凈、干燥的工作臺(tái)上，編號(hào)；

3.3.2用加樣器吸取樣品增菌液150RL,加入檢測(cè)卡一端的加樣孔；

3.3.32min?20min內(nèi)讀取結(jié)果。陰性樣品在視窗上部出現(xiàn)一條單一的紅色對(duì)照線，這表

明試劑已正確流動(dòng)且檢測(cè)過(guò)程己發(fā)生。陽(yáng)性樣品將顯示兩條紅色帶，這表明檢出0157抗原。

如果紅色條帶HI現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)失敗，應(yīng)考慮重做。

3.4免疫磁珠集菌

將0157膠體金試紙呈陽(yáng)性的mEC增菌肉湯，進(jìn)行免疫磁珠集菌。

3.4.1取下磁鐵板，將編好號(hào)的1.5mL的Eppendorf離心管，置入DynalMPC-M架上。

3.4.2輕柔混勻抗0157免疫磁珠（反復(fù)顛倒，直到管底沉淀完全消失），吸取抗0157

免疫磁珠，置入每只編號(hào)的Eppendorf離心管中20pL。

3.4.3取膠體金試紙陽(yáng)性增菌培養(yǎng)物1mL,加入上述對(duì)應(yīng)的Eppendorf離心管中。蓋緊蓋

子。輕輕顛倒混勻。

3.4.4置于DynalMX3旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器上，室溫下，旋轉(zhuǎn)30min（如果沒(méi)有旋轉(zhuǎn)器，可人工旋

轉(zhuǎn)）。

3.4.5將磁鐵板插入DynalMPC-M管架中，反復(fù)顛倒數(shù)次，將抗0157免疫磁珠吸附沉淀

在Eppendorf離心管壁上。吸去上清（包括殘留在管蓋上的液體），并棄掉。

3.4.6將磁鐵板從DynalMPC-M架抽出。每只Eppendorf離心管中加入1mLPBS-Tween20

（PH7.4）,輕輕顛倒混勻，重新懸浮免疫磁珠。

3.4.7重復(fù)3.4.5?3.4.6步驟

3.4.8重復(fù)3.4.5步驟。

3.4.9用50|iLPBS-Tween20重新懸浮免疫磁珠細(xì)菌混合物。

3.5接種選擇性平板

將50gL免疫磁珠細(xì)菌混合物用接種環(huán)劃線或L棒涂布分別接種于O157:H7科瑪嘉顯

色平板或山梨醇麥康凱平板（SMAC）各一塊，36℃±1℃培養(yǎng)18h?24h；

在SMAC平板上O157:H7菌落應(yīng)為扁平、透明或半透明、表面光滑濕潤(rùn)、不發(fā)酵山梨

醇乳白色菌落，極少部分遲緩發(fā)酵山梨醇，呈紅色。邊緣光滑，直徑約2mm。在0157：

H7科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上呈淡紫色或紫紅色菌落。

3.6初步鑒定

對(duì)疑似菌落染色為革蘭陰性桿菌者，在上述平板挑取疑似菌落10?20個(gè)，轉(zhuǎn)種克氏雙

糖（KIA）培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)16h?20h。如其生長(zhǎng)性狀為葡萄糖（+）、乳糖（+）、

13

產(chǎn)氣（+）、硫化氫（-）者。

3.7診斷血清凝集試驗(yàn)

可疑菌株可用大腸埃希氏菌0157抗血清和0157單克隆抗體進(jìn)行玻片凝集，凝集強(qiáng)度

達(dá)（+++）,再用H7抗血清凝集鑒定。同時(shí)設(shè)鹽水做對(duì)照。上述，冷凍，真空抽干，并于

真空狀態(tài)下封口保存。若患者不能自然排除O157:H7與腸桿菌科的某些菌種存在抗原交叉

現(xiàn)象，例如：弗勞地檸檬酸桿菌、赫爾曼埃希氏菌、沙門(mén)氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌等,

一般可通過(guò)單克隆抗體解決，但弗勞地枸椽酸桿菌與O157:H7的0抗原交叉反應(yīng)用單克隆

抗體也無(wú)法辨別，只可通過(guò)檢測(cè)O抗原編碼基因鑒別。

3.8API20E生化鑒定試劑盒

采用API20E生化鑒定試劑盒進(jìn)行鑒定，生化反應(yīng)編碼:大多為5144172,極少數(shù)為

1144172或5144162。

4菌株保存和定期上送

4℃或室溫保存的半固體培養(yǎng)基保菌菌種至少2套（穿刺接種后36℃培養(yǎng)過(guò)夜即可）

或30%甘油肉湯凍存管-70℃保存菌株至少2套。按照方案要求定期上送。

5多重PCR毒力基因鑒定

PCR擴(kuò)增0157、H7編碼基因，并且檢測(cè)st”、s/x2、〃6eae毒力基因。典型的造成

人類感染的大腸埃希氏菌O157:H7為0157+、H7+,并且攜帶志賀毒素、溶血素與粘附抹

平因子：sfx/+、sfx2+、hfy+、eae+,我國(guó)大部分O157:H7菌株不攜帶stv/,為stxl-、stx2+>

hfy+、eae+o

多重PCR各對(duì)引物序列見(jiàn)表7。

表7多重PCR毒力基因鑒定的引物

目標(biāo)基因引物序列片段大?。╞p）

StX\F5=ATAAATCGCCATTCGTTGACTAC-3'180

R5'-AGAACGCCCACTGAGATCATC3

StX2F5'-GGCACTGTCTGAAACTGCTCC3255

R5'-TCGCCAGTTATCTGACATTCT-3'

eaeAF5'-GACCCGGCACAAGCATAAGC-31384

R5'-CCACCTGCAGCAACAAGAGG-31

hlyAF5=GCATCATCAAGCGTACGTTCC3534

R51-AATGAGCCAAGCTGGTTAAGCT3

%O157F5'-CGGACATCCATGTGATATGG3259

R51-TTGCCTATGTACAGCTAATCC-3'

5.1模板DNA提?。河脽崃呀夥?，將純化的可疑菌株接種5mL營(yíng)養(yǎng)肉湯，36℃±1℃培

養(yǎng)6h或過(guò)夜，10000r/min離心5min,棄上清；加入1mL生理鹽水，震蕩分散細(xì)菌，10000

r/min離心5min,棄上清;沉淀加100pL無(wú)菌蒸儲(chǔ)水，重新震蕩懸浮后置100℃水浴10min；

10000r/min離心5min,上清用于PCR擴(kuò)增。陽(yáng)性和陰性對(duì)照分別為我們保存的產(chǎn)志賀氏

毒素1和2的大腸埃希氏菌O157:H7和不具備上述6種基因的大腸埃希氏菌，同法制備。

14

5.2多重PCR反應(yīng)體系：模板DNA提取液5HL,IOXPCR緩沖液5RL,分別加終濃度

1.5mMMgCl2,0.2mMdNTP,每種引物500nM,TaqDNA聚合酶1.5RL,最后加無(wú)菌蒸

儲(chǔ)水至總體積50gLo

5.3多重PCR反應(yīng)條件：除變性溫度由950c改為94℃和增加最后72。。延伸外，均按

Paton法。1?10循環(huán)，94"C1min變性；65℃2min退火；72℃1.5min延伸。11?25

循環(huán)，94℃1min；60℃2min；72℃1.5min。26?35循環(huán)，94℃1min；65℃2min；

72℃2.5mine最后72℃10min。

5.4擴(kuò)增產(chǎn)物用含EB(0.5pg/mL)的2%瓊脂糖電泳，陽(yáng)陰性對(duì)照正常，紫外燈下觀察結(jié)

果，照相記錄。

15

(六)副溶血性弧菌檢驗(yàn)操作程序

1范圍

本程序規(guī)定了糞便標(biāo)本中副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的檢驗(yàn)方法。

2檢驗(yàn)程序

副溶血性弧菌檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖4°

糞便或肛拭子

V

3%氯化鈉堿性蛋白陳水

36℃±1℃,12h-16h

V

TCBS或科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基

36℃±1℃,18h~24h

▼

挑取3個(gè)或以上可疑菌落，接種于3%氯化鈉胰蛋白陳大豆瓊脂

36℃±1℃,18h~24h

氧化酶試驗(yàn)，3%氯化鈉三糖鐵瓊脂，嗜鹽性試驗(yàn)

進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定

V

血清學(xué)分型、PCR毒力基因鑒定

V

結(jié)果與報(bào)告

圖4副溶血性弧菌檢驗(yàn)程序

3操作步驟

3.1標(biāo)本收集

標(biāo)本包括新鮮的或轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便或肛拭子。最優(yōu)標(biāo)本是轉(zhuǎn)移至

Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便拭子。肛拭子不是最佳標(biāo)本，僅在病人無(wú)糞便標(biāo)本時(shí)采用。肛

拭子收集后應(yīng)當(dāng)目測(cè)，需要在拭子上明顯見(jiàn)到糞便。

16

所采集的標(biāo)本盡快檢驗(yàn)，放入Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基中的標(biāo)本應(yīng)在室溫條件下24h內(nèi)

送檢。新鮮的糞便標(biāo)本置于清潔、干燥、無(wú)肥皂或消毒液殘留的容器中，室溫條件F8h

內(nèi)送檢。

3.2分離培養(yǎng)

新鮮糞便：無(wú)菌拭子采集少量糞便，將拭子放入3%氯化鈉堿性蛋白陳水。輕擰管蓋。

注意：拭子表面有一層標(biāo)本即可，不可將過(guò)量的標(biāo)本放入堿性蛋白陳水。

肛拭子：操作程序同新鮮糞便。

轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便拭子：輕攪混合標(biāo)本；將拭子放入3%氯化鈉堿性

蛋白陳水。輕擰管蓋。注意：拭子表面有一層標(biāo)本即可，不可將過(guò)量的標(biāo)本放入堿性蛋白

陳水。

堿性蛋白陳水于36℃±1℃培養(yǎng)12h?16h,于TCBS平板或科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基

平板上劃線分離，36℃±1℃培養(yǎng)18h?24h。

3.3菌落特征

典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落，用接種環(huán)輕

觸，有類似口香糖的質(zhì)感，直徑2mm?3mm。從培養(yǎng)箱取出TCBS平板后，應(yīng)盡快（不

超過(guò)1h）挑取菌落或標(biāo)記要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基匕

呈圓形、半透明、表面光滑的粉紫色菌落，直徑2mm?3mm。

3.4純培養(yǎng)

挑取3個(gè)或以上可疑菌落，劃線接種3%氯化鈉胰蛋白月東大豆瓊脂平板，36℃±1℃培

養(yǎng)18h-24ho

3.5初步鑒定

3.5.1氧化酶試驗(yàn)：挑選純培養(yǎng)的單個(gè)菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，副溶血性弧菌為氧化酶陽(yáng)性。

3.5.2挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，轉(zhuǎn)種3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層，36℃

±1七培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。副溶血性弧菌在3%氯化鈉三糖鐵瓊脂中的反應(yīng)為底層變黃不變

黑，無(wú)氣泡，斜面顏色不變或紅色加深，有動(dòng)力。

3.5.3嗜鹽性試驗(yàn)：挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，分別接種0%、6%、8%和10%不同氯化

鈉濃度的胰腺水，36c±1°C培養(yǎng)24h,觀察液體混濁情況。副溶血性弧菌在無(wú)氯化鈉和

10%氯化鈉的胰陳水中不生長(zhǎng)或微弱生長(zhǎng)，在6%氯化鈉和8%氯化鈉的胰陳水中生長(zhǎng)旺盛。

3.6確定鑒定

刮取3%氯化鈉胰蛋白陳大豆瓊脂平板上的單個(gè)菌落，進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定試劑盒鑒定。

4血清學(xué)分型

4.1制備：接種兩管3%氯化鈉胰蛋白腺大豆瓊脂試管斜面，36℃±1℃培養(yǎng)18h?24h。

用含3%氯化鈉的5%廿油溶液沖洗3%氯化鈉胰蛋白陳大豆瓊脂斜面培養(yǎng)物，獲得濃厚的菌

懸液。

4.2K抗原的鑒定：取一管上述制備好的菌懸液，首先用多價(jià)K抗血清進(jìn)行檢測(cè)，出現(xiàn)凝

集反應(yīng)時(shí)再用單個(gè)的抗血清進(jìn)行檢測(cè)。用蠟筆在一張玻片上劃出適當(dāng)數(shù)量的間隔和一個(gè)對(duì)

照間隔。在每個(gè)間隔內(nèi)各滴加一滴菌懸液，并對(duì)應(yīng)加入一滴K抗血清。在對(duì)照間隔內(nèi)加一

滴3%氯化鈉溶液。輕微傾斜玻片，使各成分相混合，再前后傾動(dòng)玻片1min。陽(yáng)性凝集反

應(yīng)應(yīng)可以立即觀察到。

4.3O抗原的鑒定：將另外一管的菌懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，121C高壓1h。高壓后4000

17

r/min離心15min,棄去上層液體，沉淀用生理鹽水洗三次，每次4000r/min離心15min,

最后一次離心后留少許上層液體，混勻制成菌懸液。用蠟筆將玻片劃分成相等的間隔。在

每個(gè)間隔內(nèi)加入一滴菌懸液，將O群血清分別加一滴到間隔內(nèi)，最后一個(gè)間隔加一滴生理

鹽水作為自凝對(duì)照。輕微傾斜玻片，使各成分相混合，再前后傾動(dòng)玻片1min。陽(yáng)性凝集反

應(yīng)應(yīng)可以立即觀察到。如果未見(jiàn)到與O群血清的凝集反應(yīng)，將菌懸液1210c再次高壓1h

后，重新檢測(cè)。如果仍舊為陰性，則培養(yǎng)物的O抗原屬于未知。根據(jù)表8報(bào)告血清學(xué)分型

結(jié)果。

表8副溶血性弧菌的抗原

O群K型

11,5,20,25,26,32,38,41,56,58,60,64,69

23,28

4,5,6,7,25,29,30,31,33,37,43,45,48,54,56,57,58,59,

3

72,75

44,8,9,10,11,12,13,34,42,49,53,55,63,67,68,73

515,17,30,47,60,61,68

618,46

719

820,21,22,39,41,70,74

923,44

1024,71

1119,36,40,46,50,51,61

1219,52,61,66

1365

5PCR毒力基因鑒定

PCR法檢測(cè)以/?（耐熱直接溶血素基因）Wtrh（TDH相關(guān)溶血素基因）毒力基因，引

物序列見(jiàn)表9。

5.1模板DNA提取：自TCBS或科瑪嘉弧菌顯色平板上挑取3個(gè)可疑菌落，劃線含3%氯

化鈉的胰蛋白豚大豆瓊脂平板?純化菌株在含3%氯化鈉的腦心浸液肉湯中36c±1℃過(guò)

夜生長(zhǎng)，10OOOxg離心10min。沉淀用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，重新懸浮于雙蒸水中，煮

沸10min。細(xì)菌裂解物立即用于PCR或-20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

5.2PCR反應(yīng)體系中包括含DNA的細(xì)菌裂解物2匹,20^mol/L的引物貯存液各1pL.dNTP

貯存液（各種dNTP的濃度為2.5mmol/1）1/，Taq聚合酶0.3陽(yáng)（TaKaRa）,lOxPCR緩

沖液5匹，總體積50注。

5.3反應(yīng)體系94℃預(yù)變性5min。PCR的循環(huán)條件見(jiàn)表9。反應(yīng)體系72℃再延伸5min。

所有反應(yīng)均設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性DNA對(duì)照。PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂凝膠中120V電泳，EB

染色，照相。

5.4PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂凝膠中120V電泳，EB染色，照相。