第十單元　第61課時　基因工程的基本工具和基本操作程序-2025年高中生物大一輪復習講義人教版

第61課時基因工程的基本工具和基本操作程序課標要求1.概述基因工程是在微生物學、生物化學和分子生物學等學科基礎上發(fā)展起來的。2.闡明重組DNA技術的三種基本工具。3.闡明基因工程的基本操作程序?？记榉治?.基因工程的基本工具2023·新課標·T62021·全國乙·T382021·湖北·T72.基因工程的基本操作程序2023·全國乙·T382023·全國甲·T382023·湖北·T42023·廣東·T202021·廣東·T22考點一基因工程的基本工具1．基因工程的概念2．基因工程的誕生和發(fā)展(1)肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗不僅證明了DNA是遺傳物質(zhì)，還證明了DNA可在同種生物不同個體之間轉(zhuǎn)移。(2)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的提出和半保留復制的證明。(3)中心法則的確立。(4)遺傳密碼的破譯。(5)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)。限制酶、DNA連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。(6)DNA體外重組的實現(xiàn)。(7)重組DNA表達實驗的成功。(8)DNA測序和合成技術的發(fā)明。(9)PCR技術的發(fā)明。(10)基因組編輯技術可以實現(xiàn)對特定基因的定點插入、敲除或替換。3．重組DNA技術的基本工具(1)限制性內(nèi)切核酸酶(簡稱“限制酶”)提醒①限制酶的識別序列一般由6個核苷酸組成，少數(shù)由4個、8個或其他數(shù)量的核苷酸組成。②限制酶作用的化學鍵只能是磷酸二酯鍵。③在切割含目的基因的DNA分子時，需用限制酶切割兩次此DNA分子，產(chǎn)生4個末端。只有這樣才能使目的基因的兩端都有可連接的黏性末端或平末端。(2)DNA連接酶(3)載體判斷正誤(1)基因工程是人工操作導致的染色體變異，變異是不定向的(×)提示基因工程是人工操作導致的基因重組，變異是定向的。(2)DNA連接酶可以連接目的基因與載體的氫鍵，形成重組DNA(×)提示DNA連接酶可以將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的磷酸二酯鍵。(3)限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和質(zhì)粒是基因工程中常用的三種工具酶(×)提示限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和質(zhì)粒是基因工程中常用的三種工具，前兩者屬于工具酶，質(zhì)粒屬于載體。(4)質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為標記基因(×)提示質(zhì)粒上的抗生素抗性基因常作為標記基因，便于重組DNA分子的篩選。將從蘇云金桿菌中獲取的Bt基因轉(zhuǎn)入棉花細胞內(nèi)培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的過程中，需借助多種分子工具且經(jīng)歷多個操作步驟。實驗人員使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割質(zhì)粒。如圖表示常用的限制酶識別序列和切割位點以及質(zhì)粒上的限制酶切割位點。請思考以下問題：(1)請用圖示法寫出限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割后形成黏性末端的過程。提示限制酶EcoRⅠ：限制酶NheⅠ：(2)切割圖示中的目的基因應選用哪類限制酶？請說明理由。提示用限制酶MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。限制酶MunⅠ和EcoRⅠ切割后形成的黏性末端相同，限制酶NheⅠ和SpeⅠ切割后形成的黏性末端相同，實驗人員使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割質(zhì)粒，應選用MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。歸納總結(jié)限制酶的選擇(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。(2)保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標記基因，所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。若載體上有兩個及以上的標記基因，則可合理對其中一些標記基因進行酶切破壞，從而達到比一個標記基因更高的篩選成功率，防止只有一個標記基因時出現(xiàn)的“假陽性”(即未成功導入目的基因的載體也能正常表達標記基因，造成無效篩選)。(3)善用“雙酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和載體上存在多種酶切位點時，一般需要選擇在目的基因所在序列和載體上都存在切割位點的兩種不同的限制酶，對目的基因所在序列和載體進行剪切，即“雙酶切法”。其優(yōu)點和作用是：①防止目的基因環(huán)化；②避免目的基因與載體反向連接，即用DNA連接酶連接后形成的重組DNA分子上，目的基因和載體啟動子的方向(或描述為“RNA聚合酶的移動方向”)必須是相同的，否則目的基因?qū)牒鬅o法正常表達。如圖甲、乙也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指來源不同，但能產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶。當不適合選擇某種限制酶時，可用其同尾酶替換，以獲得相同的黏性末端。考向一辨析基因工程的基本工具1．(2021·湖北，7)限制性內(nèi)切核酸酶EcoRⅠ識別并切割雙鏈DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蠅基因組DNA，理論上得到DNA片段的平均長度(堿基對)約為()A．6B．250C．4000D．24000答案C解析據(jù)圖可知，EcoRⅠ的酶切位點有6個堿基對，由于DNA分子的堿基組成為A、T、G、C，則某一位點出現(xiàn)該序列的概率為1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4＝1/4096，即4096個堿基對可能出現(xiàn)一個限制酶EcoRⅠ的酶切位點，故理論上得到DNA片段的平均長度(堿基對)約為4096，與4000最接近，C符合題意。2．(2024·連云港高三調(diào)研)質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體，質(zhì)粒有標記基因(如圖所示)，通過標記基因可以推知外源基因(目的基因)是否轉(zhuǎn)移成功。質(zhì)粒上箭頭表示三種限制酶的酶切位點。外源基因插入的位置不同，細菌在培養(yǎng)基上的生長情況不同。如表是外源基因插入(插入點有a、b、c)后細菌的生長情況。下列有關敘述正確的是()項目細菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長情況細菌在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長情況①能生長不能生長②能生長能生長③不能生長能生長A.質(zhì)粒的復制原點上有RNA聚合酶的結(jié)合位點B．①②③三種重組后細菌的外源基因插入點①是a，②是c，③是bC．質(zhì)粒被一種限制酶切開時，被水解的磷酸二酯鍵有2個D．將外源基因與質(zhì)粒連接時需用DNA聚合酶答案C解析質(zhì)粒的復制原點上有DNA聚合酶的結(jié)合位點，A錯誤；①②③三種重組后細菌的外源基因插入點①是b，②是c，③是a，B錯誤；將外源基因與質(zhì)粒連接時需用DNA連接酶，D錯誤。歸納提升與DNA有關的幾種酶的比較考點二基因工程的基本操作程序1．目的基因的篩選與獲取(1)目的基因：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產(chǎn)物等的基因。(2)篩選合適的目的基因①從相關的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。②利用序列數(shù)據(jù)庫和序列比對工具進行篩選。(3)目的基因的獲?、偃斯ず铣赡康幕?。②PCR獲取和擴增目的基因a．PCR(聚合酶鏈式反應)：是一項根據(jù)DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。b．PCR反應的條件：一定的緩沖溶液、DNA模板、2種引物、4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶，以及能自動調(diào)控溫度的儀器。c．PCR擴增的過程d．PCR產(chǎn)物的鑒定：常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。歸納提升PCR技術和DNA復制的比較③通過構(gòu)建基因文庫來獲取目的基因。2．基因表達載體的構(gòu)建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。(2)基因表達載體的組成及作用(3)構(gòu)建過程提醒啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比項目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)DNADNAmRNAmRNA位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號(編碼氨基酸)翻譯的結(jié)束信號(正常情況下，不編碼氨基酸)3.將目的基因?qū)胧荏w細胞生物種類植物動物微生物常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法顯微注射法Ca2＋處理法受體細胞體細胞或受精卵受精卵原核細胞轉(zhuǎn)化過程將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA中→農(nóng)桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA上→表達將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)→基因表達載體導入辨析(1)轉(zhuǎn)化：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實質(zhì)都是基因重組。(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導入第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受體細胞的染色體DNA上；第一次導入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導入農(nóng)桿菌，第二次導入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA導入受體細胞。4．目的基因的檢測與鑒定判斷正誤(1)目的基因一定是編碼蛋白質(zhì)的基因(×)提示目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。(2)真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應緩沖溶液中一般要添加Mg2＋(√)(3)基因表達載體中的啟動子和終止子決定著翻譯的開始與結(jié)束(×)提示啟動子和終止子決定著轉(zhuǎn)錄的開始與結(jié)束。(4)Ti質(zhì)粒上的T－DNA可與植物受體細胞的染色體DNA整合在一起(√)(5)為培育抗除草劑的作物新品種，導入抗除草劑基因時只能以受精卵為受體(×)提示為培育抗除草劑的作物新品種，導入抗除草劑基因時能以受精卵為受體，也能以體細胞為受體。(6)檢測目的基因是否導入受體細胞可用抗原—抗體雜交技術(×)提示檢測目的基因是否導入受體細胞的方法是PCR等技術。1．Bt抗蟲蛋白基因(簡稱Bt基因)是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因，篩選Bt基因后可以利用PCR技術對其進行大量擴增?；卮鹣铝袉栴}：(1)什么是引物？DNA復制時為什么需要引物？提示引物是指一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。在DNA擴增時，DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3′端延伸DNA鏈，因此復制DNA時應加入兩種引物。(2)PCR擴增Bt基因需要知道Bt基因的全部核苷酸序列嗎？提示不需要，只要知道Bt基因兩端的部分核苷酸序列即可(以便根據(jù)這部分序列合成兩種引物)。(3)為檢測Bt基因在轉(zhuǎn)基因抗蟲棉細胞中是否轉(zhuǎn)錄，科研人員提取棉花細胞中的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄過程獲得總cDNA，通過PCR技術可在總cDNA中專一性地擴增出Bt基因的cDNA，原因是什么？提示引物是依據(jù)Bt毒蛋白基因的一段已知序列設計合成的(或引物能與Bt基因的cDNA特異性結(jié)合)。(4)PCR擴增過程中的循環(huán)圖示與規(guī)律如圖所示，若一個Bt毒蛋白基因在PCR中經(jīng)過n輪循環(huán)，理論上得到多少個DNA分子？含引物的DNA分子多少個？含其中一種引物的DNA分子多少個？同時含兩種引物的DNA分子多少個？共需要消耗多少個引物？含不等長脫氧核苷酸鏈的DNA分子多少個？含等長脫氧核苷酸鏈的DNA分子多少個？提示經(jīng)過n輪循環(huán)，得到2n個DNA分子，含引物的DNA分子2n個，含其中一種引物的DNA分子數(shù)(2n－1)個，同時含兩種引物的DNA分子(2n－2)個，共需要消耗(2n＋1－2)個引物。含不等長脫氧核苷酸鏈的DNA分子2n個，含等長脫氧核苷酸鏈的DNA分子(2n－2n)個。(5)PCR擴增Bt基因的過程中需要解旋酶嗎？并說明理由。所需要的DNA聚合酶應具有什么特點？提示不需要解旋酶，因為PCR過程中，DNA雙鏈在高溫下即可完成解旋。由于PCR過程溫度較高，故所需要的DNA聚合酶應具有耐高溫的特點。2．據(jù)圖分析抗蟲棉的培育過程。(1)該過程中的目的基因是Bt基因，載體是Ti質(zhì)粒。(2)基因工程中，往往使用兩種限制酶切割目的基因，這樣做的原因是什么？提示為了避免目的基因和載體的自身環(huán)化和反向連接。(3)為了保證目的基因在受體細胞中能正確表達，對目的基因在質(zhì)粒中的插入位點有什么要求？提示目的基因應插入啟動子與終止子之間。(4)該實例中，導入目的基因的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。為什么目的基因可以整合到染色體的DNA上？提示由于Ti質(zhì)粒上的T－DNA可轉(zhuǎn)移到受體細胞且能整合到受體細胞的染色體DNA上，而目的基因又插入T－DNA，所以目的基因可以整合到受體細胞的染色體DNA上。(5)將目的基因?qū)胧荏w細胞時，能否僅把目的基因整合到線粒體DNA或葉綠體DNA上？為什么？提示一般不能。如果僅把目的基因整合到線粒體DNA或葉綠體DNA上，由于細胞分裂可能導致目的基因丟失，無法穩(wěn)定遺傳。(6)該實例中，檢測目的基因是否成功表達的常見方法有哪些？提示抗原—抗體雜交、用棉葉飼喂棉鈴蟲。考向二辨析基因工程的基本操作程序3．(2023·湖北，4)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達載體(重組質(zhì)粒)，并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯誤的是()A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落答案D解析若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同，A正確；若用PvuⅠ酶切，重組質(zhì)粒和質(zhì)粒中都有四環(huán)素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；DNA凝膠電泳技術可以分離出不同大小的DNA片段，重組質(zhì)粒的大小與原質(zhì)粒不同，能夠鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否，C正確；SphⅠ的酶切位點位于四環(huán)素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重組質(zhì)粒中含氨芐青霉素抗性基因(AmpR)，因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)的培養(yǎng)基中能形成菌落，在含Tet的培養(yǎng)基中不能形成菌落，D錯誤。4．(2024·江蘇揚州中學高三模擬)土壤農(nóng)桿菌侵染植物細胞時，Ti質(zhì)粒上的T－DNA片段轉(zhuǎn)入植物的基因組。利用農(nóng)桿菌以Ti質(zhì)粒作為載體進行轉(zhuǎn)基因，下列相關敘述正確的是()A．目的基因應插入T－DNA片段外，以防止破壞T－DNAB．用Ca2＋處理農(nóng)桿菌，以利于其侵染植物細胞C．Ti質(zhì)粒是一種環(huán)狀DNA分子，沒有雙螺旋結(jié)構(gòu)D．可以用PCR技術檢測外源DNA是否整合到植物的染色體DNA上答案D解析在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，需要將目的基因插入到T－DNA片段上，有利于介導外源DNA整合到植物的染色體DNA上，A錯誤；農(nóng)桿菌侵染植物細胞不需要用Ca2＋處理，B錯誤；Ti質(zhì)粒是一種環(huán)狀DNA分子，是存在于細菌細胞質(zhì)中的DNA，具有雙螺旋結(jié)構(gòu)，C錯誤。1.(選擇性必修3P67)基因工程：按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。2．(選擇性必修3P71)限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。3．(選擇性必修3P72)載體上有特殊的標記基因，便于重組DNA分子的篩選。4．(選擇性必修3P77)PCR反應需要在一定的緩沖溶液中才能進行，需提供DNA模板、2種引物、4種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶。5．(選擇性必修3P77)真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應緩沖液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸，引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸。6．(選擇性必修3P80)基因表達載體的構(gòu)建的目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用?；虮磉_載體是載體的一種，除目的基因、標記基因外，還必須含有啟動子、終止子等。啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終表達出人類需要的蛋白質(zhì)。7．(選擇性必修3P81)轉(zhuǎn)化：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。8．(選擇性必修3P81～82)將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ㄊ寝r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法；導入動物細胞的方法是顯微注射法；導入微生物細胞的方法是Ca2＋處理法。9．(選擇性必修3P82)目的基因的檢測與鑒定：首先是分子水平的檢測，包括通過PCR等技術檢測棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因或檢測Bt基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA；從轉(zhuǎn)基因棉花中提取蛋白質(zhì)，用相應的抗體進行抗原—抗體雜交，檢測Bt基因是否翻譯成Bt抗蟲蛋白等。其次，還需要進行個體生物學水平的鑒定。例如，通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲來確定Bt基因是否賦予了棉花抗蟲特性以及抗性的程度。10．如圖為所用載體圖譜示意圖，圖中限制酶的識別序列及切割位點為：HindⅢ(A↓AGCTT)、PvitⅡ(CAG↓CTG)、KpnⅠ(G↓GTACC)、EcoRⅠ(G↓AATTC)、PstⅠ(CTGCA↓G)、BamHⅠ(G↓GATCC)。為使phb2基因(該基因序列不含圖中限制酶的識別序列)與載體正確連接，在擴增的phb2基因兩端分別引入PvitⅡ和EcoRⅠ兩種不同限制酶的識別序列。將經(jīng)過這兩種酶酶切的phb2基因和載體進行連接時，可選用T4DNA連接酶(填“E.coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”)。課時精練一、選擇題1．(2024·泉州高三質(zhì)檢)像BclⅠ(－T↓GATCA－)、BglⅡ(－A↓GATCT－)、MboⅠ(－↓GATC－)這樣，識別序列不同，但能產(chǎn)生相同的黏性末端的一類限制酶被稱為同尾酶。如圖表示目的基因及質(zhì)粒上的酶切位點。選用不同的限制酶對質(zhì)粒和目的基因進行切割，并用DNA連接酶進行連接。下列分析錯誤的是()

選項切割質(zhì)粒切割目的基因結(jié)果分析ABclⅠ和BglⅡBclⅠ和BglⅡ形成的重組質(zhì)粒的堿基排列順序不一定相同BBclⅠ和BglⅡMboⅠ切割后的質(zhì)粒不可自我環(huán)化，切割后的目的基因可以自我環(huán)化CMboⅠBclⅠ和BglⅡ形成的重組質(zhì)?？杀籑boⅠ再次切開，但可能無法被BclⅠ和BglⅡ再次切開DMboⅠMboⅠ切割后的質(zhì)?？梢宰晕噎h(huán)化，切割后的目的基因也可以自我環(huán)化答案B解析切割質(zhì)粒和切割目的基因均用BclⅠ和BglⅡ時，切割后產(chǎn)生的黏性末端相同，形成重組質(zhì)粒時目的基因可能反向連接，形成的堿基排列順序不一定相同，A正確；用BclⅠ和BglⅡ切割質(zhì)粒，切割后產(chǎn)生的黏性末端相同，切割后的質(zhì)?？赡茏晕噎h(huán)化，B錯誤；切割質(zhì)粒用MboⅠ，切割目的基因用BclⅠ和BglⅡ，產(chǎn)生相同的黏性末端，形成的重組質(zhì)粒中有MboⅠ的切割位點，但不一定有BclⅠ和BglⅡ的切割位點，因此形成的重組質(zhì)粒可被MboⅠ再次切開，但可能無法被BclⅠ和BglⅡ再次切開，C正確；切割質(zhì)粒用MboⅠ，切割目的基因用MboⅠ，切割后的質(zhì)粒和目的基因均可以自我環(huán)化，D正確。2．(2023·新課標，6)某同學擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應限制酶的識別序列和切割位點)和質(zhì)粒進行切割、連接，以構(gòu)建重組表達載體。限制酶的切割位點如圖所示。下列重組表達載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是()A．質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B．質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C．質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D．質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接答案C解析酶3切割后得到的是平末端，應該用T4DNA連接酶連接，A不符合題意；質(zhì)粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到黏性末端，二者不能連接，B不符合題意；質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA連接酶連接后，還能保證目的基因在質(zhì)粒上的連接方向，此重組表達載體的構(gòu)建方案最合理且高效，C符合題意；若用酶2和酶4切割質(zhì)粒和目的基因，會破壞質(zhì)粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達載體缺少標記基因，無法進行后續(xù)的篩選，D不符合題意。3．(2023·重慶，12)某小組通過PCR(假設引物長度為8個堿基短于實際長度)獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進行酶切(下圖)，再用所得片段成功構(gòu)建了基因表達載體。下列敘述錯誤的是()A．其中一個引物序列為5′－TGCGCAGT－3′B．步驟①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠC．用步驟①的酶對載體進行酶切，至少獲得了2個片段D．酶切片段和載體連接時，可使用E.coliDNA連接酶或T4DNA連接酶答案B解析由于引物只能引導子鏈從5′端到3′端延伸，根據(jù)堿基互補配對原則，其中一個引物序列為5′－TGCGCAGT－3′，A正確；根據(jù)三種酶的酶切位點，左側(cè)的黏性末端是使用NheⅠ切割形成的，右邊的黏性末端是用CfoⅠ切割形成的，B錯誤；用步驟①的限制酶NheⅠ和限制酶CfoⅠ對載體(環(huán)狀DNA)進行酶切，切割之后至少獲得了2個片段，C正確；E.coliDNA連接酶只能連接黏性末端，T4DNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端，圖中酶切后形成的是黏性末端，酶切片段和載體連接時，可使用E.coliDNA連接酶或T4DNA連接酶，D正確。4．(2024·鎮(zhèn)江高三二模)轉(zhuǎn)基因植物中標記基因的剔除可有效防止基因污染，剔除常用分離剔除法和重組剔除法。分離剔除法是在轉(zhuǎn)基因時將目的基因和標記基因分別構(gòu)建在兩個Ti質(zhì)粒上，通過共轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因植物后讓其自交得到不含標記基因的轉(zhuǎn)基因個體；重組剔除法利用Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)，Cre酶能有效剔除重組載體中含有標記基因的序列，只留下一個LoxP位點，具體原理如圖。下列說法不正確的是()A．利用分離剔除法時，目的基因和標記基因都應插到Ti質(zhì)粒的T－DNA序列內(nèi)部B．分離剔除時目的基因和標記基因插到植物細胞的同源染色體或非同源染色體上均可成功C．上述重組載體中啟動子1在農(nóng)桿菌中可發(fā)揮作用，而在植物細胞中不能發(fā)揮作用D．經(jīng)重組剔除后的標記基因，因沒有啟動子而無法啟動基因的轉(zhuǎn)錄答案C解析Ti質(zhì)粒的T－DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體DNA上，所以利用分離剔除法時，目的基因和標記基因都應插到Ti質(zhì)粒的T－DNA序列內(nèi)部，進而成功整合到受體細胞染色體DNA上，A正確；分離剔除時目的基因和標記基因插到植物細胞的同源染色體或非同源染色體上最終均可獲得不含標記基因的轉(zhuǎn)基因個體，即均可成功，B正確；重組剔除時，Cre酶基因應該在植物細胞中表達，故上述重組載體中啟動子1在農(nóng)桿菌中不能發(fā)揮作用，而在植物細胞中能發(fā)揮作用，C錯誤；由圖可知，經(jīng)重組剔除后的標記基因沒有啟動子，無法啟動基因的轉(zhuǎn)錄，D正確。5．如圖是培育抗除草劑玉米的技術路線圖，含有內(nèi)含子的報告基因只能在真核生物中正確表達，其產(chǎn)物能催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍色。轉(zhuǎn)化過程中愈傷組織表面常殘留農(nóng)桿菌，會導致未轉(zhuǎn)化的愈傷組織可能在含除草劑的培養(yǎng)基中生長。下列相關敘述正確的是()A．過程①中除草劑抗性基因插入T－DNA中，導致T－DNA片段失活B．過程①用兩種限制酶就可防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化C．過程②用Ca2＋處理，使農(nóng)桿菌細胞壁通透性改變，使其處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)D．過程③應在培養(yǎng)基中加入除草劑和物質(zhì)K答案D解析過程①中除草劑抗性基因插入T－DNA中，不會導致T－DNA片段失活，A錯誤；過程①使用兩種限制酶，且這兩種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端不同，才可以防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化，B錯誤；過程③應在培養(yǎng)基中加入除草劑和物質(zhì)K，除草劑是用來檢測目的基因是否正確表達，物質(zhì)K是用來檢測目的基因有沒有導入植物細胞中，加入除草劑可保留轉(zhuǎn)化的愈傷組織和附著農(nóng)桿菌但未轉(zhuǎn)化的愈傷組織，其中變藍的為轉(zhuǎn)化的愈傷組織，D正確。6．(2024·西安高三一模)我國科學家利用XbaⅠ和SacⅠ兩種限制酶，并運用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，將富含賴氨酸的蛋白質(zhì)編碼基因(含678bp)導入某植物細胞，再經(jīng)植物組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株，使賴氨酸的含量比對照組明顯提高，如圖表示相關培育過程(質(zhì)粒的其他部位和目的基因內(nèi)部均無XbaⅠ、SacⅠ、HindⅢ的識別位點)，下列說法不正確的是()A．一個內(nèi)含目的基因的模板DNA經(jīng)PCR擴增4次，共產(chǎn)生8個等長DNA分子B．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是將目的基因?qū)胫参锛毎某Ｓ梅椒–．植物組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基需添加卡那霉素以便篩選轉(zhuǎn)基因植株D．使用SacⅠ和HindⅢ切割重組質(zhì)粒后能得到1500bp左右的片段答案C解析一個內(nèi)含目的基因的模板DNA經(jīng)PCR擴增4次共產(chǎn)生等長的DNA分子數(shù)24－2×4＝8(個)，A正確；因為插入植物細胞染色體上的是質(zhì)粒的T－DNA，而卡那霉素抗性基因不在此片段上，導入成功的植物細胞對卡那霉素無抗性，C錯誤；根據(jù)切割目的基因的限制酶在質(zhì)粒上的切割位點，可知由于重組質(zhì)粒上移除1900bp而補充了含678bp的目的基因，加上未移除的822bp，所以用SacⅠ和HindⅢ切割重組質(zhì)粒后，可得到822＋678＝1500(bp)左右的新片段，D正確。7．自然界中很少出現(xiàn)藍色的花，天然藍色花產(chǎn)生的主要原因是花瓣細胞液泡中花青素在堿性條件下顯藍色。我國科學家利用鏈霉菌的靛藍合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)構(gòu)建基因表達載體(如圖)，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導入白玫瑰中，在細胞質(zhì)基質(zhì)中形成穩(wěn)定顯色的靛藍。下列相關敘述錯誤的是()A．上述獲得藍色玫瑰的方案中不需要轉(zhuǎn)入能調(diào)控液泡pH的基因B．將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠC．同時使用SpeⅠ和SacⅠ能提高idgS基因和Ti質(zhì)粒的重組效率D．sfp和idgS基因具有各自的啟動子，表達是相互獨立進行的答案B解析靛藍能夠穩(wěn)定顯色，不受pH的影響，故本題方案中不需要轉(zhuǎn)入能調(diào)控液泡pH的基因，A正確；將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時若使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ，則會將終止子一同切除，故只能用BamHⅠ，B錯誤。8．(2024·莆田高三質(zhì)檢)如圖表示利用基因工程生產(chǎn)黃金大米時所構(gòu)建的基因表達載體，其中基因Ⅰ和基因Ⅱ是β－胡蘿卜素合成所必需的基因，基因Ⅲ表達的蛋白質(zhì)可使細菌在特殊培養(yǎng)基上生長。下列分析錯誤的是()A．A序列是該基因表達載體的復制原點B．基因Ⅲ的作用是便于篩選該重組質(zhì)粒C．β－胡蘿卜素是檢測基因Ⅰ、基因Ⅱ表達的關鍵指標之一D．圖中基因插入質(zhì)粒時需要限制酶和DNA連接酶答案A解析由題圖可知，每個基因前都存在A序列，可推測該序列應為啟動子序列，啟動子是RNA聚合酶識別與結(jié)合的位點，一個質(zhì)粒一般只有一個復制原點，A錯誤。9．(2024·南京高三聯(lián)考)某課題組為得到青蒿素產(chǎn)量高的新品系，使青蒿素合成過程中的某一關鍵酶基因fps在野生青蒿中過量表達，其過程如圖所示。下列有關敘述錯誤的是()A．也可用PCR技術直接擴增RNA來獲取目的基因B．酶1、酶2和酶3作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵C．本過程中，可以采用一種、兩種甚至四種酶2D．通過抗原—抗體雜交技術可檢測fps基因是否表達出蛋白質(zhì)答案A解析PCR技術不能直接擴增RNA來獲取目的基因，A錯誤；據(jù)圖可知，酶1表示逆轉(zhuǎn)錄酶，酶2表示限制酶，酶3表示DNA連接酶，酶1、酶2和酶3作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵，B正確；不同的限制酶切割可能產(chǎn)生相同的黏性末端，因此為了成功構(gòu)建表達載體，可以采用一種、兩種甚至四種酶2切割含fps基因的DNA片段和質(zhì)粒a，C正確。10．(2024·徐州高三質(zhì)檢)圖甲為培育轉(zhuǎn)基因生物時選用的載體，圖乙是含有目的基因的一段DNA序列，圖中標注了相關限制酶的酶切位點。下列敘述錯誤的是()A．若通過PCR技術提取該目的基因，應該選用引物a和引物cB．構(gòu)建表達載體時可選用BclⅠ和HindⅢ這兩種限制酶C．若將基因表達載體導入大腸桿菌中，需用Ca2＋處理大腸桿菌D．只利用含四環(huán)素的培養(yǎng)基就可以直接篩選出成功導入表達載體的受體細胞答案D解析根據(jù)圖甲可知，BamHⅠ會導致兩種抗性基因都被破壞，所以不宜選用BamHⅠ，為防止目的基因自身環(huán)化，可選用BclⅠ和HindⅢ兩種限制酶切割，B正確；由于選擇BclⅠ和HindⅢ這兩種限制酶，破壞了氨芐青霉素抗性基因，但沒有破壞四環(huán)素抗性基因，因此應該先用含四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選出含有基因表達載體和普通質(zhì)粒的大腸桿菌，再用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，D錯誤。二、非選擇題11．(2021·全國乙，38)用重組DNA技術可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中要使用多種工具酶，其中4種限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點如圖所示?；卮鹣铝袉栴}：(1)常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶，上圖中酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接，上圖中切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學鍵是。(3)重組DNA技術中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征，如質(zhì)粒DNA分子上有復制原點，可以保證質(zhì)粒在受體細胞中；質(zhì)粒DNA分子上有，便于外源DNA的插入；質(zhì)粒DNA分子上有標記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細胞，方法是。(4)表達載體含有啟動子，啟動子是指。答案(1)EcoRⅠ、PstⅠEcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅤ(2)磷酸二酯鍵(3)自我復制一至多個限制酶切割位點用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細胞(4)位于基因上游的一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，是RNA聚合酶識別及結(jié)合的部位，能驅(qū)動轉(zhuǎn)錄過程解析(1)限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coliDNA連接酶來源于大腸桿菌，只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來，而T4DNA連接酶來源于T4噬菌體，可用于連接黏性末端和平末端，但連接效率較低。因此圖中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coliDNA連接酶連接，除了這兩種限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4DNA連接酶連接。(2)DNA連接酶將兩個DNA片段連接形成磷酸二酯鍵。(3)質(zhì)粒是小型環(huán)狀的DNA分子，常作為基因表達的載體，首先質(zhì)粒上含有復制原點，能保證質(zhì)粒在受體細胞中自我復制。質(zhì)粒DNA分子上有一個至多個限制酶的切割位點，便于目的基因的導入。質(zhì)粒上的標記基因便于重組DNA分子的篩選，具體做法是用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細胞。(4)啟動子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終表達出人類需要的蛋白質(zhì)。12．(2021·福建，21)微生物吸附是重金屬廢水的處理方法之一。金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在于動植物中的金屬結(jié)合蛋白，具有吸附重金屬的作用?？蒲腥藛T將棗樹的MT基因?qū)氪竽c桿菌構(gòu)建工程菌?；卮鹣铝袉栴}：(1)根據(jù)棗樹的MTcDNA的核苷酸序列設計了相應的引物(圖1甲)，通過PCR擴增MT基因。已知A位點和B位點分別是起始密碼子和終止密碼子對應的基因位置。選用的引物組合應為。(2)本實驗中，PCR所用的DNA聚合酶擴增出的MT基因的末端為平末端。由于載體E只有能產(chǎn)生黏性末端的酶切位點，需借助中間載體P將MT基因接入載體E。載體P和載體E的酶切位點及相應的酶切序列如圖1乙所示。①選用酶將載體P切開，再用(填“T4DNA”或“E.coli81DNA”)連接酶將MT基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P′。②載體P′不具有表達MT基因的和。選用酶組合對載體P′和載體E進行酶切，將切下的MT基因和載體E用DNA連接酶進行連接，將得到的混合物導入到用離子處理的大腸桿菌，篩出MT工程菌。(3)MT基因在工程菌的表達量如圖2所示。結(jié)果仍無法說明已經(jīng)成功構(gòu)建能較強吸附廢水中重金屬的MT工程菌，理由是。答案(1)引物1和引物4(2)①EcoRⅤT4DNA②啟動子終止子XhoⅠ和PstⅠ鈣(3)尚未在個體生物學水平上對MT工程菌吸附重金屬的能力進行鑒定解析(1)密碼子位于mRNA上，是決定氨基酸的三個相鄰堿基，起始密碼子和終止密碼子分別控制翻譯的開始和結(jié)束，故為保證基因的正常表達，一對引物應分別位于位點A和位點B的兩側(cè)，故選擇引物1和引物4。(2)①MT基因的末端為平末端，故需要用EcoRⅤ或SmaⅠ切割載體P，但后續(xù)需進一步將重組載體P′和載體E連接，故需將MT基因插入XhoⅠ和PstⅠ兩個酶切位點之間，故選EcoRⅤ將載體P切開；由于E.coli81DNA連接酶只能連接黏性末端，而T4DNA連接酶可以連接平末端，MT基因的末端為平末端，故需要用T4DNA連接酶將MT基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P′。②由圖可知，載體P′不含有表達MT基因的啟動子和終止子；為避免自身環(huán)化和反向連接，