GBT 35901-2018 豬圓環(huán)病毒2型熒光PCR檢測(cè)方法

豬圓環(huán)病毒2型熒光PCR檢測(cè)方法中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。1豬圓環(huán)病毒2型熒光PCR檢測(cè)方法26試劑6.1除非另有說明，在檢測(cè)中使用的試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)室用水應(yīng)符合GB/T6682的要求。6.2DNAzol,商品化DNA抽提試劑，于2℃~8℃保存。6.475%乙醇，無水乙醇和雙蒸水配制，-20℃預(yù)冷。6.58mmol/LNaOH溶液，配制見附錄A。6.6PBS緩沖液(0.01mol/LPBS,pH7.4),配制見附錄A。6.7Taq酶及10倍Taq酶反應(yīng)緩沖液：Taq酶濃度為5U/μL,Taq酶反應(yīng)緩沖液中Mg2+濃度6.8dNTPs:含dATP、dGTP、dC6.9引物和TaqMan探針，其序列見附錄B。6.10豬圓環(huán)病毒2型陽性對(duì)照樣品和陰性對(duì)照樣品：陽性對(duì)照使用滅活疫苗或組織培養(yǎng)滅活毒，-20℃保存?zhèn)溆?；陰性?duì)照可采用健康豬的組織材料。7樣品采集和處理7.1采樣工具7.1.3真窒采血管。7.2樣品來集7.2.1血清樣品采集：用無菌注射器抽取受檢豬靜脈血不少手-5mL,置于無菌離心管內(nèi)，室溫或者37℃傾斜放置自然凝集20min～30min,2000r/min～3000r/min離心10min,吸取上清液到新的離心管內(nèi)備用。7.2.2糞便樣品采集。取豬新鮮糞便1g,裝入15mL滅菌離心管中，加人5mLPBS,混勻。7.2.3精液樣品采集：按照GB/T25172的方法采集和保存精液7.2.4組織樣品采集：采取病死豬(包括流產(chǎn)的死胎)或撲殺豬主要臟器(淋巴結(jié)、脾臟、肺臟、腎臟和肝臟)裝入滅菌15mL離心管中，編號(hào)，送實(shí)驗(yàn)室。7.2.5細(xì)胞培養(yǎng)物：細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，第3次解凍后，將細(xì)胞培養(yǎng)物置于1.5mL無DNA酶的滅菌離心管內(nèi)，編號(hào)備用。7.3樣品保存和運(yùn)輸上述采集的樣品可立即用于檢測(cè)。不能立即檢測(cè)的樣品，在2℃~8℃下保存應(yīng)不超過24h,-20℃±5℃可以穩(wěn)定保存3個(gè)月，-70℃以下可長期保存。樣品運(yùn)送采用低溫保存進(jìn)行運(yùn)輸，并在規(guī)定溫度下的保存期內(nèi)送達(dá)。7.4樣品處理7.4.1血清和精液樣品無需進(jìn)行前處理，直接用于核酸提取。7.4.2糞便樣品：3000r/min離心10min,取上清液，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，用于后續(xù)的核酸提取。35min,取上清用于后續(xù)的核酸提取。8熒光PCR操作程序8.1DNA抽提8.1.2取n個(gè)滅菌的1.5mL離心管，其中n為待檢樣品數(shù)十陽性對(duì)照+陰性對(duì)照，對(duì)每個(gè)離4℃或室溫10000F/min離心5min。8.2熒光PCR檢測(cè)在試劑配制區(qū)進(jìn)行。設(shè)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)管數(shù)為為待檢樣品數(shù)斗陽性管數(shù)+陰性管數(shù)，每個(gè)反應(yīng)的體系見附錄C,為了避免移液器取樣損失，建議按n+1個(gè)反應(yīng)進(jìn)行配制。配制反應(yīng)液在冰盒456引物和探針名稱序列PCV2-P(探針)5'-FAM-CCGCTCACTT