NYT 2249-2012 菠蘿凋萎病病原分子檢測技術規(guī)范

菠蘿凋萎病病原分子檢測技術規(guī)范Technicalspecificationofmoleculardetectionforpineapplemeal中華人民共和國農(nóng)業(yè)部發(fā)布1NY/T2249—2012下列文件對于本文件的應用是必不可少的凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修政出適用于本文件SN/T1193基因檢驗實驗家技術要求3術語和定義下列術語和定義適用文本文件包括菠蘿凋萎伴隨病毒(Pineapplemealybugwilir-Lsociated1),菠蘿凋萎伴隨病毒2號PMWaV=2)和菠蘿凋萎伴隨病毒3號(PMWaV-3)。工計的兩條引物分別與模板DNA兩條鏈上相應的一段互補序列發(fā)生退火而互相結合，接著在DNA聚合RT-PCR是先利用依賴于RNA的DNA聚合酶，將待測RNA逆轉錄為DNA;再以逆轉錄后的一tRNAm是攜帶延長肽鏈上甲硫氨酸的tRNA,它負責識別延伸中AUG密碼子。tRNAm結合區(qū)2NY/T2249—2012為基因間隔區(qū)，該結合區(qū)為所有桿狀病毒(Badnavirus)所共有。根據(jù)PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的HSP-70特有堿基序列設計特異性引物進行RT-PCR擴增，依據(jù)是否分別擴增獲得預期的590bp、611bp和499bp的DNA片段，判斷樣品中是否攜帶菠蘿凋萎伴隨病毒；根據(jù)PBCoV的tRNA結合區(qū)特有堿基序列設計特異性引物進行PCR擴增，依據(jù)是否擴增獲得預期973bp的DNA片段，判斷樣品中是否攜帶菠蘿桿狀病毒。按B.1和B.2的規(guī)定執(zhí)行。以田間菠蘿大苗植株或冠芽較片或波蘿組培苗葉片作為檢測樣品，取樣量為1.0g~5.0g,實驗室檢測用樣量為9.1g。7檢測方法參照附錄B的方法提取檢測樣品和對照樣品的總RNA.段超純水作為空白對照進行RTPCR擴增。引物正反義擴增片一段長度PMWaV-1RPMWaV-2RPMWaV-3F正義PMWaV-3R7.1.3RT-PCR擴增反應RT-PCR反應體系：苜?；ㄈ~病毒(AMV)反轉錄酶反應緩沖液12.5L,分別加入10μmol/L的引物PMWaV-1F、PMWaV-1R.PMWaV-2E,PMWaV-2R與PMWaV-3F、PMWaV-3R各1.5μL,RNA1μL,AMV反轉錄酶混合液1L,加無RNA酶的超純水至25μL。RT-PCR反應條件：50℃反轉錄30min:94℃反應2min滅活反轉錄酶，94℃30s,不同溫度退火(檢測PMWaV-1退火溫度為60℃,PMWaV-2和PMWaV-3退火溫度為55℃)1min,72℃延伸1min,30個循環(huán)；最后72℃延伸7min。取出PCR反應管，對反應產(chǎn)物進行電泳檢測或4℃條件下保存，存放時間不超過24h。7.2.1引物序列PBCoV-F:5'-AGAAAAGAGAATGAACPBCoV-R:5'-AGTGATAAAGGGTCAAPCR片段長度為973bp。37.2.2PCR擴增反應體系：10×PCR緩沖液(Mg2+Plus)2.5μL,TaqDNA聚合酶(5U/pμL)0.25μL,四種脫氧核糖核PCR反應條件：94℃2min;然后進入35個循環(huán)，94℃30s,52℃30s,72℃1min;最后72℃延伸10min。取出PCR反應管，對反應產(chǎn)物進行電泳檢測或4℃條件下保存，存放時間不超過24h。7.3反應體系中對照的設置7.3.1陽性對照樣品以溫室培養(yǎng)經(jīng)菠蘿粉蚧傳毒接種后，呈現(xiàn)典型癥狀確定感染菠蘿凋萎伴隨病毒的菠蘿葉片為材料，提取總RNA,以其為模板合成cDNA第一鏈，作為PMWaVs檢測體系的陽性對照。以溫室培養(yǎng)經(jīng)菠蘿粉蚧傳毒接種后，呈現(xiàn)典型癥狀確定感染菠蘿桿狀病毒的菠蘿葉片為材料，提取基因組DNA,作為PBCoV檢測體系的陽性對照。7.3.2陰性對照樣品用脫毒的菠蘿組培苗提取的總核酸作為樣品陰性對照。7.3.3PCR反應體系陰性對照用配制反應體系的無菌超純水代替DNA模板，檢測試劑是否受到污染。8瓊脂糖電泳9凝膠成像分析將電泳后的瓊脂糖凝膠置于紫外凝膠成像儀系統(tǒng)觀察窗內(nèi)，根據(jù)DNA分子量標準估計擴增條帶的大小，并拍照保存，參考圖1和圖2。圖1菠蘿凋萎伴隨病毒PCR檢測結果電泳圖圖2菠蘿桿狀病毒PCR檢測結果電泳圖4PMWaV-2F、PMWaV-2R與PMWaV-3F、PMWaV-3R)或PCR檢測(加入引物PBCoV-F、5A.1.2菠蘿桿狀病毒狀DNA病毒屬(Bndnatir顯(圖A.1)。678