微生物的選擇培養(yǎng)與計數課件 【知識精講精研】 高二下學期生物人教版選擇性必修三

1.2.2微生物的選擇培養(yǎng)和計數聚合酶鏈式反應（PCR）是一種在體外擴增DNA片段的技術，此項技術要求使用耐高溫的DNA聚合酶。尋找耐高溫的DNA聚合酶1973年，布魯克在美國黃石國家公園的一個熱泉中發(fā)現了耐熱的水生棲熱菌，并從這種菌種提取出耐高溫的DNA聚合酶。討論：1.篩選水生棲熱菌的思路是什么樣的？耐高溫的酶耐高溫生物體高溫環(huán)境（熱泉、火山口）尋找尋找

2.為什么水生棲熱菌能從熱泉中篩選出來呢？篩選原因：水生棲熱菌能在70-80℃高溫條件下生存，

而絕大多數微生物在此條件下不能生存。尋找目的菌種時要根據它對生存環(huán)境的要求，到相應的環(huán)境中去尋找。篩選原則耐熱微生物耐寒微生物石油分解菌一、選擇培養(yǎng)基1.概念:2.類型:在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基稱為選擇培養(yǎng)基。（1）改變培養(yǎng)條件。70～80℃的高溫分離耐高溫的水生棲熱菌使用將pH調至酸性的培養(yǎng)基分離耐酸菌（2）改變培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分。不加碳源（含碳有機物）的培養(yǎng)基不加氮源的培養(yǎng)基分離出固氮菌分離出自養(yǎng)型微生物（3）添加某種化學物質。加入青霉素分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基分離得到金黃色葡萄球菌怎樣選擇出抗氨芐（biàn）青霉素能力的細菌?培養(yǎng)基中加氨芐青霉素具有抗氨芐青霉素能力的菌落沒有氨芐青霉素抗性的細菌培養(yǎng)基+氨芐青霉素培養(yǎng)基沒有抗氨芐青霉素能力的菌落被淘汰思考怎么證明一個選擇培養(yǎng)基具有選擇性呢？

應該設置基礎培養(yǎng)基（如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）或完全培養(yǎng)基作為對照，若基礎培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基中生長的菌落數多于該選擇培養(yǎng)基，則該選擇培養(yǎng)基具有選擇性?；A培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基那么如果讓你分離土壤中分解尿素的細菌，你應該怎么設計呢？選擇培養(yǎng)基配方的設計思考討論尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化學性質穩(wěn)定，是一種重要的農業(yè)氮肥，尿素不能直接被農作物吸收，土壤中的細菌將尿素分解成NH3，再被轉化為NO3-、NH4+等被植物吸收。細菌利用尿素的原因土壤中的細菌分解尿素是因為他們能合成脲酶。CO(NH2)2+H2O2NH3+CO2

脲酶思考討論1.如果讓你配制一種培養(yǎng)基，將土壤稀釋液中能分解尿素

的細菌分離出來，培養(yǎng)基的配方該如何設計？用尿素作為唯一氮源。2.該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點和不同點？

只是用尿素作為唯一氮源，培養(yǎng)基的其他營養(yǎng)成分基本相同。選擇培養(yǎng)基配方的設計現學現用牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g瓊脂20.0g蒸餾水定容到1000ml培養(yǎng)基一KH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g瓊脂15.0g蒸餾水定容到1000ml培養(yǎng)基二2.從用途上來講，培養(yǎng)基二屬于

培養(yǎng)基，目的是為了獲得

。3.兩種培養(yǎng)基共有的培養(yǎng)基成分有：

。培養(yǎng)基一的碳源為

，氮源為

；培養(yǎng)基二的碳源為

，氮源為

。1.從物理性質來講，兩者屬于_____培養(yǎng)基，判斷依據是______________________。該類培養(yǎng)基的主要用途為

。固體添加了凝固劑瓊脂分離、鑒定、計數選擇能分解尿素的微生物碳源、氮源、無機鹽、水牛肉膏蛋白胨葡萄糖尿素劃分標準培養(yǎng)基種類特點用途物理性質化學成分用途不加凝固劑加凝固劑，如瓊脂工業(yè)生產觀察微生物的運動、分類鑒定微生物分離、鑒定、活菌計數、保藏菌種含化學成分不明確的天然物質工業(yè)生產培養(yǎng)基成分明確分類、鑒定在培養(yǎng)基中加入某種化學物質,以抑制不需要的微生物的生長,促進所需要的微生物的生長培養(yǎng)、分離出特定微生物在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品,用以鑒別不同種類的微生物鑒別不同種類微生物選擇培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)基的類型及用途二、微生物的選擇培養(yǎng)方法:稀釋涂布平板法主要過程:A、梯度稀釋菌液B、涂布平板將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。稀釋度足夠高時，能在培養(yǎng)基表面形成單個菌落。要對土壤進行充分稀釋，然后再將菌液涂布到制備好的選擇培養(yǎng)基上。由于土壤細菌的數量龐大，那么怎么獲得要想得到特定微生物的純培養(yǎng)物呢？問答1）選擇培養(yǎng)基的制備2）對土壤樣品進行稀釋3）涂布平板操作4）培養(yǎng)并觀察培養(yǎng)基菌落5）計數土壤樣品中菌落數目1.選擇培養(yǎng)基的制備：①原理：絕大多數微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出分解尿素的細菌。②配方：葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g瓊脂15.0g蒸餾水1000mL①提供無機鹽；②調節(jié)pH。2.對土壤樣品進行稀釋：細菌宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長，絕大部分分布在距地表3~8cm的土壤層。鏟去表層土3cm左右，取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。（1）土壤取樣取土樣時用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。（2）樣品的稀釋將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻。取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。1×101mL1mL1mL1mL1mL1mL1×1021×1031×1041×1051×1061×1079mL無菌水90mL無菌水10g3.涂布平板操作：①取0.1mL

菌液滴加到培養(yǎng)基表面1×107移液器②將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中③將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進行涂布④用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉動培養(yǎng)皿，使涂布均勻過多會導致菌液在培養(yǎng)基表面形成積液，導致菌體堆積，影響分離效果。4.培養(yǎng)并觀察培養(yǎng)基菌落：

待涂布的菌液被

后，將平板

，放入

中培養(yǎng)

d，在涂布有

菌液的平板上就可以觀察到分離的

。培養(yǎng)基吸收倒置恒溫培養(yǎng)箱1~2合適濃度單菌落恒溫培養(yǎng)箱

細菌一般選用104、105、106稀釋倍數的菌液進行涂布培養(yǎng)。

4.培養(yǎng)并觀察培養(yǎng)基菌落：培養(yǎng)時要將一個未接種的培養(yǎng)基和一個已接種的培養(yǎng)基放在一起培養(yǎng)，為什么？未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長很關鍵，如果無菌落生長，說明了什么？培養(yǎng)未接種的培養(yǎng)基的作用是對照。未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫一段時間后，如果無菌落生長，說明培養(yǎng)基制備成功、合格，未受到污染。注意事項1.10g土樣加入盛有90mL無菌水中后，已稀釋10倍，再計算時，不要忽略；2.由于使用的是選擇培養(yǎng)基，所以一般情況下，獲得的單菌落即目的菌，但因為有些微生物可以利用目的菌的代謝產物來生長繁殖，所以還需要進一步驗證；3.過程中所有操作都應在酒精燈火焰旁進行；4.將涂布器從酒精中取出時，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后再放在火焰上灼燒；不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。常用微生物分離方法比較比較平板劃線法稀釋涂布平板法工具接種環(huán)涂布器原理在數次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由一個細菌細胞繁殖而來的肉眼可見的細胞群體，即菌落在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細菌細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落特點方法簡單，但不適宜計數單菌落更易分開，可以計數，但操作復雜共同點使培養(yǎng)基上形成由單個細菌細胞繁殖而來的子細胞群體——菌落三、微生物的數量測定

當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過計數平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。1.稀釋涂布平板法2.顯微鏡直接計數法——間接計數法——直接計數法1.間接計數法—稀釋涂布平板法一般選擇30-300個菌落的平板進行計數；每個稀釋度至少取3個平板取其平均值；統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數目低；統(tǒng)計的結果一般用菌落數而不是活菌數來表示’計數原則:

當兩個或多個菌體連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍空白對照恰當的稀釋度、涂布是否均勻是成功統(tǒng)計菌落數目的關鍵。計算公式:M代表稀釋倍數C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)每毫升原液中的菌落數＝

(C÷V)×M例題:某同學取10克土樣溶解于90mL無菌水中，在稀釋倍數為106

的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數的平均數為234，那么每毫升原液中的菌落數是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1mL)()A.2.34×108B.2.34×1010C.2.34×109D.23.4C

某兩位同學用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數。從對應稀釋倍數為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結果：甲同學在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數為230；乙同學在該濃度下涂布了A、B、C三個平板，統(tǒng)計的菌落數分別為21、212、256，該同學以這三個平板上菌落數的平均值163作為統(tǒng)計結果。請評價這兩位同學的實驗結果的有效性：1.甲同學____________________________________；原因是____________________________________。2.乙同學____________________________________；原因是____________________________________。實驗操作不合理未設置重復實驗組結果計算不合理21與另外兩組數值相差太大，應舍去2.直接計數法——顯微鏡直接計數法①原理：利用細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數量。血細胞計數板：細菌計數板：常用于相對較大的酵母菌細胞、霉菌孢子等的計數。對細菌等較小的細胞進行觀察和計數。②缺點：a.不能區(qū)分死菌和活菌→偏大;b.不適于對運動細菌的計數;c.個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察。③優(yōu)點：快速、直觀較薄0.02mm較厚0.1mm④血細胞計數板計數方法：每毫升原液所含菌體數＝每小格平均菌體數×400×10000×稀釋倍數注意：統(tǒng)計結果一般是活菌數和死菌數的總和。

（“染色排除法”）微生物的數量測定內容直接計數法間接計數法主要用具顯微鏡、細菌計數板或血細胞計數板涂布器計數依據菌體個數培養(yǎng)基上菌落數優(yōu)點計數方便、操作簡單計數的是活菌缺點不能區(qū)分死菌與活菌操作較復雜且有一定誤差計算公式每毫升原液含菌株數＝400×1000×每小格平均菌株數×稀釋倍數每毫升原液含菌株數＝平均菌落數/所用涂布液體積×稀釋倍數實驗：土壤中分解尿素的細菌的分離與計數1.實驗目的（1）從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌（2）統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌2.實驗原理絕大多數微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用

的_____培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出

的細菌。脲酶以尿素作為唯一氮源選擇分解尿素CO(NH2)2+H2O2NH3+CO2

脲酶

常見的分解尿素的微生物：芽孢桿菌、小球菌、棒狀桿菌等細菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g瓊脂15.0g蒸餾水1000mL3.研究思路1）土壤取樣2）制備培養(yǎng)基①選擇培養(yǎng)基：以尿素為唯一氮源②牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：作為對照組，來判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用3）樣品稀釋與取樣涂布

不同微生物在土壤中含量不同，分離不同的微生物采用不同的稀釋度，以保證獲得菌落數在30～300之間，適于計數的平板。測細菌數：一般用104、105、106稀釋液測放線菌：一般用103、104、105稀釋液測真菌數：一般用102、103、104稀釋液①每個濃度至少設置4個平板選擇培養(yǎng)基（平行重復）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用以判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用）。②本實驗使用的平板和試管較多，為了避免混淆，最好在使用前做好標記。例：標記注明組別、培養(yǎng)日期和平板上培養(yǎng)樣品的稀釋度等。4）微生物的培養(yǎng)與觀察①培養(yǎng)條件：

不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。②觀察：

每隔24h統(tǒng)計一次菌落數目，選取菌落數目穩(wěn)定時的記錄作為結果。（一般來說，在相同的培養(yǎng)條件下，同種微生物表現出穩(wěn)定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等）。（細菌一般在30-37℃的溫度下培養(yǎng)1-2d）得到的菌落一定是分解尿素的細菌嗎？不一定，還需要進一步的鑒定5）結果分析與評價結合對照組，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落。如果沒有接種的培養(yǎng)基上沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。如果接種后的完全培養(yǎng)基上的菌落數明顯多于選擇培養(yǎng)基上的菌落數，說明選擇培養(yǎng)基篩選出了一些尿素分解菌。5）結果分析與評價2.你是否獲得了某一稀釋度下菌落數為30～300的平板？

在這一稀釋度下，是否至少有2個平板的菌落數接近？如果得到了兩個或多個菌落數為30~300的平板，說明稀釋度合適，操作比較成功，能夠進行菌落的計數。3.你統(tǒng)計的每克土樣中能分解尿素的細菌的菌落數是多少？與其他同學統(tǒng)計的結果接近嗎？如果差異很大，可能是什么原因引起的？如果是用同一土樣進行的操作，數據應該比較接近。如果差異很大，就需要從操作是否規(guī)范、培養(yǎng)基配制是否合理等方面查找原因。土壤中分解尿素的細菌的分離與計數5）結果分析與評價內容現象結論有無雜菌污染的判斷對照的培養(yǎng)皿中無菌落生長未被雜菌污染培養(yǎng)基中菌落數偏高被雜菌污染菌落形態(tài)多樣，菌落數偏高培養(yǎng)基中混入其他雜菌選擇培養(yǎng)基的篩選作用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數目大于選擇培養(yǎng)基上的數目選擇培養(yǎng)基具有篩選作用樣品的稀釋操作得到3個或3個以上菌落數目在30~300的平板操作成功重復組的結果若選取同一土樣，統(tǒng)計結果應接近CO(NH2)2+H2O脲酶CO2+2NH3土壤中分解尿素的細菌的鑒定原理：

在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細菌后，如果pH升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素。鑒定培養(yǎng)基方法：呈堿性，遇酚紅指示劑呈紅色。

在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細菌后，如果pH升高