巨噬細(xì)胞竟然還有這么多亞群？Cancer Discovery發(fā)文揭秘巨噬細(xì)胞空間異質(zhì)性與臨床意義

巨噬細(xì)胞竟然還有這么多亞群？CancerDiscovery發(fā)文揭秘巨噬細(xì)胞空間異質(zhì)性與臨床意義巨噬細(xì)胞作為組織內(nèi)的免疫哨兵細(xì)胞，在免疫防御中具有多重功能，包括病原體的識(shí)別與防御、抗原的呈遞、吞噬垂死細(xì)胞以及分泌信號(hào)促進(jìn)組織修復(fù)。在腫瘤中，巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)常與不良的疾病預(yù)后相關(guān)聯(lián)，因此被視為潛在的癌癥治療靶點(diǎn)。然而，目前針對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）的單一療法在實(shí)體瘤治療中效果有限，主要是因?yàn)檫@些方法未能充分考慮到巨噬細(xì)胞的多樣性。因此，深入解析巨噬細(xì)胞的分子特征和功能異質(zhì)性，將有助于開(kāi)發(fā)更為有效的靶向治療策略，并提高臨床治療效果的預(yù)測(cè)能力。近日美國(guó)斯坦福大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)在《CancerDiscovery》（IF=30.8）上發(fā)表了名為“Spatiallysegregatedmacrophagepopulationspredictdistinctoutcomesincoloncancer”的文章。對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的scRNAseq數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，結(jié)合包括Phencycler-Fusion(PCF)空間單細(xì)胞蛋白組等的多種空間技術(shù)，深入剖析了腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞群體，發(fā)現(xiàn)了它們的空間分布與患者臨床結(jié)果之間的顯著關(guān)聯(lián)。這些腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）不僅在腫瘤進(jìn)展中扮演著多重角色，而且其異質(zhì)性為癌癥治療提供了新的視角。1、通過(guò)scRNA-seq鑒定巨噬細(xì)胞亞群標(biāo)志物研究團(tuán)隊(duì)利用四個(gè)公開(kāi)的結(jié)直腸癌和乳腺癌scRNAseq數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)了不同巨噬細(xì)胞亞型的標(biāo)記物（圖1A），通過(guò)基因差異富集情況，共區(qū)分了11個(gè)轉(zhuǎn)錄亞群，3個(gè)單核細(xì)胞亞群、5個(gè)TAM亞群（腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞）、3個(gè)TRM亞群（組織駐留巨噬細(xì)胞）（圖1C、D），其中FOLR2+TRM亞群尚未報(bào)道過(guò)。作者驗(yàn)證六種巨噬細(xì)胞亞群的marker對(duì)應(yīng)的商品化抗體，以IL4I1、NLRP3、SPP1、FOLR2、LYVE1和MARCO蛋白表達(dá)為基礎(chǔ)來(lái)分辨TAM和TRM群體（圖1G）。圖1通過(guò)scRNA-seq鑒定巨噬細(xì)胞亞群2、FOLR2、IL4I1、NLRP3和SPP1標(biāo)記TME中空間上不同的巨噬細(xì)胞生態(tài)位為了研究乳腺癌和結(jié)腸癌TME中巨噬細(xì)胞標(biāo)記物的空間分布，作者使用CD68和CD163作為典型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物，使用IL4I1、NLRP3和SPP1來(lái)區(qū)分TAM亞群，使用FOLR2來(lái)區(qū)分TRM。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以往普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為的與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的CD163+細(xì)胞本研究反而定位于距離腫瘤更遠(yuǎn)的部位（圖2B），而CD68表達(dá)較高的巨噬細(xì)胞則浸潤(rùn)并緊緊包圍腫瘤巢（圖2B、D）。FOLR2的表達(dá)與良性組織有關(guān)，其位置離腫瘤較遠(yuǎn)（圖2E-G），在空間上與CD163表達(dá)較高的巨噬細(xì)胞共定位（圖2D）。而表達(dá)IL4I1、NLRP3和SPP1的巨噬細(xì)胞則富集在腫瘤附近，在空間上與CD68表達(dá)較高的巨噬細(xì)胞共定位（（圖2Dii）。IL4I1+巨噬細(xì)胞存在于腫瘤巢周?chē)拇倮w維增生基質(zhì)中，F(xiàn)OLR2+巨噬細(xì)胞存在于更遠(yuǎn)的周?chē)夹越M織中。這表明腫瘤的存在以類(lèi)似的方式塑造TME中的巨噬細(xì)胞表型和分布，而與腫瘤類(lèi)型或腫瘤是原發(fā)性還是轉(zhuǎn)移性無(wú)關(guān)。該團(tuán)隊(duì)將分析研究擴(kuò)展到了八個(gè)不同器官起源癌癥，發(fā)現(xiàn)所有分析的腫瘤中均存在FOLR2+TRMs和IL4I1+TAM的空間異質(zhì)性。圖2FOLR2、IL4I1、NLRP3和SPP1在TME中標(biāo)記巨噬細(xì)胞異質(zhì)性3、IL4I1標(biāo)記吞噬巨噬細(xì)胞IL4I1定位于抗原呈遞細(xì)胞的溶酶體中，提示其在吞噬作用中起作用。使用基因集富集分析進(jìn)一步研究吞噬作用與IL4I1陽(yáng)性TAMs之間的關(guān)聯(lián)。發(fā)現(xiàn)與其他所有scRNA巨噬細(xì)胞亞型相比，CXCL9陽(yáng)性TAMs（IL4I1陽(yáng)性TAMs的一個(gè)亞群）在吞噬體、溶酶體、內(nèi)吞作用和抗原處理與呈遞基因集表達(dá)中最為富集（圖3A）。現(xiàn)SIRPA（編碼CD47配體）和CD274（編碼PD-L1）都在表達(dá)IL4I1的scRNA髓系簇中富集，包括SPP1陽(yáng)性TAMs、ISG15陽(yáng)性TAMs和CXCL9陽(yáng)性TAMs（圖4B）。提示IL4I1陽(yáng)性TAMs可能是抗CD47和抗PD-L1免疫療法的潛靶點(diǎn)，這些療法可能影響IL4I1陽(yáng)性TAMs的吞噬潛力。無(wú)論是治療前還是治療后，響應(yīng)治療的患者中表達(dá)IL4I1的scRNATAMs的頻率都增加了（圖4C、D），表明IL4I1是PD-1-PD-L1軸阻斷反應(yīng)的潛在新預(yù)測(cè)標(biāo)記。圖3IL4I1標(biāo)記吞噬巨噬細(xì)胞4、PCF空間單細(xì)胞蛋白組揭示結(jié)腸癌和乳腺癌組織內(nèi)巨噬細(xì)胞生態(tài)位的空間細(xì)胞相互作用在確定了IL4I1、NLRP3、SPP1、FOLR2和LYVE1巨噬細(xì)胞群體在空間上存在異質(zhì)性之后，作者利用PhenoCycler-Fusion（PCF）空間單細(xì)胞蛋白組（原CODEX）在乳腺和結(jié)腸良性及腫瘤組織切片上同時(shí)可視化36個(gè)蛋白標(biāo)記以揭示這些細(xì)胞的空間關(guān)系。PCF抗體組包含四種常規(guī)的髓系標(biāo)記物（CD16、CD68、CD163、CD206）和三種巨噬細(xì)胞亞群特異性標(biāo)記物（SPP1、LYVE1和FOLR2）。利用PCF確定了兩種上皮細(xì)胞類(lèi)型、七種基質(zhì)細(xì)胞類(lèi)型和15種免疫細(xì)胞類(lèi)型，在免疫細(xì)胞類(lèi)型中，分辨出了五種巨噬細(xì)胞群。PCF成像結(jié)果證實(shí)前期scRNAseq和IF結(jié)果，并且能夠識(shí)別良性和腫瘤組織中巨噬細(xì)胞亞型與其他細(xì)胞類(lèi)型之間的空間關(guān)聯(lián)。具體的，SPP1+TAMs與CD68+TAMs共同富集在腫瘤細(xì)胞附近，定位于缺氧的腫瘤區(qū)域，并與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)。相比之下，CD163+TRMs、FOLR2+TRMs和LYVE1+TRMs則共同富集在距離腫瘤較遠(yuǎn)的鄰近良性組織中（圖4B-D）。FOLR2+TAM構(gòu)成腸肌壁中的組織駐留巨噬細(xì)胞群，并與腸道固有層和結(jié)締乳腺組織中的漿細(xì)胞相關(guān)。來(lái)自乳腺結(jié)締組織或腸肌壁的FOLR2+TRMs可以被捕獲在生長(zhǎng)的腫瘤巢內(nèi)，從而成為T(mén)ME的一部分（圖4F）。圖4CODEX揭示了巨噬細(xì)胞微環(huán)境中的空間細(xì)胞相互作用5、SPP1+TAMs在缺氧和壞死腫瘤區(qū)域富集，NLRP3+TAM激活TME中的NLRP3炎癥小體PCF空間細(xì)胞鄰域分析揭示了SPP1+TAM與中性粒細(xì)胞在空間共富集。作者還發(fā)現(xiàn)NLRP3+TAM在中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的腫瘤區(qū)域富集（圖5A）。然而SPP1+TAM與含有壞死組織的區(qū)域相關(guān)（圖5B）。作者使用了公開(kāi)的10×VisiumFFPE人乳腺癌樣本進(jìn)一步探討SPP1+TAM與壞死的關(guān)聯(lián)，結(jié)果表明該樣本中的壞死腫瘤區(qū)域富含SPP1+基因表達(dá)而非NLRP3+基因表達(dá)（圖5C）。這些結(jié)果表明，NLRP3+TAMs很可能有助于嗜中性粒細(xì)胞在TME中的招募，而SPP1+TAMs可能在吞噬壞死腫瘤區(qū)域中發(fā)揮作用。研究團(tuán)隊(duì)使用CosMxSMI等技術(shù)發(fā)現(xiàn)NLRP3+TAMs通過(guò)激活NLRP3炎性體參與炎癥的發(fā)生，并驅(qū)動(dòng)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。相反，SPP1+TAMs通過(guò)清除缺氧腫瘤區(qū)域的壞死病灶，在組織修復(fù)中發(fā)揮作用（圖5D）。圖5NLRP3+TAMs和SPP1+TAMs的功能異質(zhì)性高IL4I1+TAMs預(yù)示CRC患者預(yù)后良好，而高SPP1+TAMs預(yù)示患者預(yù)后不良作者將IL4I1+TAMs和SPP1+TAMs的豐度與結(jié)直腸癌患者的臨床結(jié)局相關(guān)聯(lián)，來(lái)闡明它們對(duì)腫瘤生物學(xué)的生物學(xué)影響。發(fā)現(xiàn)IL4I1+TAMs在兩個(gè)獨(dú)立的結(jié)直腸癌隊(duì)列中是良好預(yù)后的強(qiáng)預(yù)測(cè)因子（圖7A、B），SPP1+TAMs則與結(jié)直腸癌的不良預(yù)后相關(guān)（圖7C）。這與SPP1+TAMs與腫瘤壞死和缺氧的空間關(guān)聯(lián)一致，而腫瘤壞死和缺氧都是腫瘤侵襲性的標(biāo)志。作者表示這是首個(gè)基于蛋白質(zhì)的證據(jù)，顯示了在實(shí)體腫瘤中，兩種TAM群體之間存在相反的臨床結(jié)局相關(guān)性。這表明不同的TAM群體之間存在分工，以不同的方式影響患者的預(yù)后。圖6IL4I1+

TAM和SPP+

TAM與CRC患者預(yù)后有關(guān)

總結(jié)與討論本研究利用單細(xì)胞公共數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘發(fā)現(xiàn)了5種巨噬細(xì)胞亞群，進(jìn)而通過(guò)包含PhenoCycler-Fusion空間單細(xì)胞蛋白組（原CODEX）在內(nèi)的多個(gè)空間組學(xué)技術(shù)深入解析了巨噬細(xì)胞群體的空間分布及其與疾病進(jìn)程的關(guān)聯(lián)。研究揭示了巨噬細(xì)胞并非隨機(jī)分布于組織，而是根據(jù)其獨(dú)特功能，占據(jù)特定的生態(tài)位。巨噬細(xì)胞的空間組織特性與其功能狀態(tài)緊密相關(guān)，針對(duì)巨噬細(xì)胞的空間特異性干預(yù)策略，可能成為未來(lái)腫瘤免疫治療的新方向，有望提高治