3.細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件-07資料

細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要細(xì)胞的生存環(huán)境溫度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4

滲透壓無(wú)污染無(wú)毒一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)及設(shè)備器材1.細(xì)胞培養(yǎng)室設(shè)計(jì)原則及要求◆保證無(wú)微生物污染和不受其他有毒、有害因素的影響具體工作：器皿洗刷試劑和培養(yǎng)液的配制制備細(xì)胞孵育細(xì)胞傳代細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇和運(yùn)輸◆必須樹(shù)立無(wú)菌觀念，堅(jiān)持一貫的無(wú)菌操作，進(jìn)行無(wú)菌處理?！魧?shí)驗(yàn)室應(yīng)分為無(wú)菌室、準(zhǔn)備室和洗刷消毒室，除洗刷消毒室須分隔開(kāi)外，無(wú)菌室和準(zhǔn)備室可在同一房間內(nèi)，但需劃分出不同功能區(qū)，即無(wú)菌操作區(qū)和培養(yǎng)、觀察區(qū)。無(wú)菌觀念1）無(wú)菌室◆為無(wú)菌操作而設(shè)計(jì)的空間，包括操作間和緩沖間?！舨僮鏖g又可分為細(xì)胞室和感染室◆緩沖間能保護(hù)無(wú)菌間的無(wú)菌環(huán)境，可兼有更換無(wú)菌衣帽和進(jìn)行一些簡(jiǎn)單操作（如放孵育箱、離心等）的功能?！粽麄€(gè)面積約10m2，通入經(jīng)濾過(guò)的無(wú)菌空氣，與周?chē)鷮?shí)驗(yàn)室比較應(yīng)保持正壓，常備紫外燈，室內(nèi)其他陳設(shè)盡量減少。

無(wú)菌室結(jié)構(gòu)模式圖back

使用無(wú)菌室時(shí)應(yīng)按以下順序：①熟悉實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，背鰭必要的材料和器具，杜絕試驗(yàn)過(guò)程中反復(fù)出入無(wú)菌室。②傳戴無(wú)菌衣帽和口罩。③關(guān)閉殺菌燈，通過(guò)一定路線拿如必要物品（應(yīng)盡量減少出入的次數(shù)）。④手部消毒后再進(jìn)行操作。⑤完成實(shí)驗(yàn)后將用完的物品移出室外。⑥擦凈實(shí)驗(yàn)臺(tái)，退出后打開(kāi)滅菌燈?！蠲咳眨ㄊ褂们埃┳贤庹丈洌?－2小時(shí)），☆每周甲醛、乳酸、過(guò)氧乙酸熏蒸（2小時(shí)）☆每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒?！顚?shí)際工作中，要根據(jù)無(wú)菌室建筑材料的差異來(lái)選擇合適的消毒方法。無(wú)菌室的維護(hù)☆注意防止無(wú)菌室的污染。造成無(wú)菌室污染的可能包括：送入無(wú)菌室的風(fēng)沒(méi)有被過(guò)濾除菌；進(jìn)出無(wú)菌室時(shí)，能使外界空氣直接對(duì)流進(jìn)無(wú)菌室的操作間；等。

2）超凈工作臺(tái)（凈化工作臺(tái)）比較密閉，分垂直流和側(cè)流式，外界空氣通過(guò)濾器從上面、側(cè)面或正面流入操作箱內(nèi)，并能形成氣流屏障，以保持臺(tái)面無(wú)菌。超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過(guò)高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過(guò)工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。

超凈臺(tái)的使用與保養(yǎng)：★平均風(fēng)速保持在0.32-0.48米/秒為宜★使用前最好開(kāi)啟超凈臺(tái)內(nèi)紫外燈照射10－30分鐘，然后讓超凈臺(tái)預(yù)工作10－15分鐘，以除去臭氧和使用工作臺(tái)面空間呈凈化狀態(tài)；★使用完畢后，要用70%酒精將臺(tái)面和臺(tái)內(nèi)四周擦拭干凈，以保證超凈臺(tái)無(wú)菌。還要定期用福爾馬林熏蒸超凈臺(tái)無(wú)菌工作臺(tái)操作布局示意圖3）無(wú)菌箱（1）大型設(shè)備工具類

①無(wú)菌室、實(shí)驗(yàn)室、超凈工作臺(tái)、無(wú)菌操作箱等②二氧化碳（CO2）孵箱、恒溫孵箱、試管架

2.設(shè)備器材CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2

。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃，14h)。③箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。倒置顯微鏡③倒置顯微鏡、普通顯微鏡、實(shí)體解剖顯微鏡及照相系統(tǒng)④高速離心機(jī)（水平式500～4000r/min）⑤普通、低溫冰箱及液氮裝置⑥藥品柜、器械柜、實(shí)驗(yàn)臺(tái)等（2）消毒滅菌設(shè)備①高壓蒸汽滅菌器②干熱滅菌器③濾過(guò)器（蔡氏濾器、微量超濾膜濾器等）④紫外燈、離子發(fā)生器⑤耐酸耐高溫容器、吸管自動(dòng)沖洗器、玻璃器皿清洗箱（3）配液用具①蒸餾水制作系統(tǒng)、陰離子交換樹(shù)脂裝置。②天平稱量系統(tǒng)。③pH儀或試紙（精密）④量筒、漏斗、溶量瓶、磁力攪拌器等（4）制備、培養(yǎng)、保存細(xì)胞用品①刀、剪、鑷等解剖用具，80～200目尼隆網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板②培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)管、培養(yǎng)板（4、6、12、24、48、96孔）、離心管③吸管、滴管、吹打管、試管④500ml、250ml、100ml、50ml等溶液瓶⑤渦流混勻器、恒溫磁力攪拌器、恒溫水浴鍋等⑥細(xì)胞凍存管等培養(yǎng)板培養(yǎng)瓶酶標(biāo)儀微孔板震蕩器二、實(shí)驗(yàn)器材的處理防止微生物污染和細(xì)胞污染1.清洗1）玻璃器皿的清洗（1）浸泡★新玻璃器皿使用前得先用自來(lái)水簡(jiǎn)單刷洗，★然后用5％鹽酸浸泡過(guò)夜；★用過(guò)的玻璃器皿往往附有大量蛋白質(zhì)和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后應(yīng)立即浸入清水中備刷洗?！镒⒁庾屗酀M瓶皿，以利充分浸泡、沖洗?！镉形廴镜钠髅蟊仨毾认緶缇笤俳?、沖洗。（2）刷洗★軟毛刷★優(yōu)質(zhì)洗滌劑或?qū)Ｓ孟礈靹镙p刷，不宜刷洗次數(shù)太多（3）浸酸◆器皿干燥后浸酸◆器皿內(nèi)要充滿清潔液，勿留氣泡◆注意安全◆浸清潔液處理后的器皿必須徹底沖洗（4）沖洗◆自來(lái)水流水沖洗◆蒸餾水沖洗3遍清潔液配制注意事項(xiàng)①選用耐酸塑料桶或不銹鋼桶配置為宜⑤清潔液腐蝕性極強(qiáng)，配置與應(yīng)用時(shí)必須小心，做好防護(hù)④清潔液配好后呈棕紅色，帶邊綠色是標(biāo)明失效③緩緩加入濃硫酸，切忌過(guò)急，否則將大量產(chǎn)熱而發(fā)生危險(xiǎn)（決不可將重鉻酸鉀液倒入濃硫酸中）②先將重鉻酸鉀溶于水中（用玻璃棒攪拌助溶，有時(shí)不能完全溶解）清洗示意圖白箭頭：玻璃制品黑箭頭：橡膠制品

back2）塑料器皿沖洗流水沖洗晾干后包裝，以備滅菌蒸餾水漂洗3次2％～5％鹽酸浸泡30min自來(lái)水沖洗2％氫氧化鈉（NaOH）浸泡過(guò)夜晾干自來(lái)水沖洗3）膠塞等橡膠類用品的處理自來(lái)水沖洗2％氫氧化鈉（NaOH）煮沸15min2％～5％鹽酸煮沸15min蒸餾水漂洗5次以上晾干后包裝自來(lái)水沖洗自來(lái)水沖洗5次以上蒸餾水煮沸10min烘干備用高壓滅菌4）金屬器械的清洗新的先用沾有汽油的紗布擦去油脂再用水洗凈最后用乙醇棉球擦拭，晾干用過(guò)的先以清水煮沸消毒，再擦拭干凈使用前以蒸餾水煮沸10分鐘，或包裝好后101.3kPa高壓滅菌15分鐘5）除菌濾器的處理2、包裝目的：防止消毒滅菌后再次遭受污染包裝材料：包裝類型：常用的包裝紙、牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、玻璃或金屬制吸管筒、紙或棉線繩局部包裝全包裝3、消毒滅菌1.干烤7.抗生素消毒滅菌6.熏蒸消毒5.射線4.紫外線2.高壓蒸汽滅菌3.濾過(guò)滅菌消毒劑類別名稱濃度(%)用途重金屬鹽紅汞2皮膚、粘膜、小創(chuàng)面消毒硫柳汞0.01生物制品防腐氧化劑高錳酸鉀0.1皮膚、尿道、水果、蔬菜消毒過(guò)氧化氫3皮膚、粘膜、創(chuàng)傷消毒過(guò)氧乙酸0.2～0.5塑料、玻璃、人造纖維消毒鹵素類碘液2.5皮膚消毒醇類乙醇70～75皮膚、體溫計(jì)消毒酚類石炭酸3～5地面、器皿表面和排泄物消毒來(lái)蘇3～5同上、也常用于手及皮膚消毒表面活性劑新潔爾滅0.1手術(shù)器械消毒酸堿類生石灰1:4～1:8排泄物、地面消毒染料龍膽紫2～4表淺創(chuàng)傷消毒8.化學(xué)消毒劑三、培養(yǎng)用液是維護(hù)組織細(xì)胞生存、生長(zhǎng)及進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)各項(xiàng)操作過(guò)程中所需的基本溶液平衡鹽溶液（balancedsaltsolution,BSS）天然培養(yǎng)液合成培養(yǎng)液1.細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)水的要求純化水蒸餾水（三蒸水）存放時(shí)間最好不要超過(guò)2周（一）離子交換裝置（二）蒸餾水裝置2.平衡鹽溶液主要成分：無(wú)機(jī)鹽葡萄糖酚紅：指示劑常用的BSS種類：（一）Hanks液（三）PBS液（二）Earle液BSS的配制要求：①要防止鈣的沉淀②要有良好的緩沖作用主要用途：①作為配制培養(yǎng)液的基礎(chǔ)溶液②配制各種試劑③用于洗滌組織和細(xì)胞水：新鮮配置的三蒸水或去離子水1.pH7.2PBS貯備液（10×）配法

NaCl8.5g

KCl0.2gNa2HPO4﹒12H2O2.85gKH2PO40.27g

溶于100ml雙蒸水中2.PBS使用液配法貯備液50ml

雙蒸水450ml細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制成分RingerPBSEarleHanksDulbeccoD-HanksNaCl(g)8.008.006.808.008.008.00KCl(g)0.420.200.400.400.200.40CaCl(g)0.25

0.200.140.10

MgCL·6H2O(g)

0.10

MgSO4·7H2O(g)

0.200.20

Na2HPO4·H2O(g)

1.56

0.06

0.06NaH2PO4·2H2O(g)

0.14

1.42

KH2PO4(g)

0.20

0.060.200.06NaHPO4(g)

2.200.35

0.35葡萄糖(g)

1.001.00

酚紅(g)

0.020.020.020.02幾種常用的BSS配方（g/L）3.細(xì)胞培養(yǎng)常用試劑1）細(xì)胞分離液（消化液）：胰蛋白酶依地酸二鈉（disodiumedetate,EDTA-2Na）膠原酶常用的消化液：

◆胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離?！粢鹊鞍酌敢簼舛仍礁撸饔迷綇?qiáng)，但超過(guò)一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。◆胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％。用濾器過(guò)濾除菌。（1）胰蛋白酶◆蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘?！糇钸m作用條件為pH8.0、37℃◆用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用（2）EDTA(0.01-0.02%)◆一種化學(xué)螯合劑，其溶液又稱Versene液◆對(duì)細(xì)胞有一定的解離作用◆毒性小，價(jià)格低廉，使用方便（3）胰酶-EDTA◆分散細(xì)胞效力好◆濃度分別為0.25和0.02%◆

-20℃保存，不易反復(fù)凍融（4）膠原酶(1-5mg/ml)◆從溶組織芽孢梭菌等細(xì)菌的培養(yǎng)液中分離得到的一組對(duì)膠原蛋白有較強(qiáng)水解作用的酶?！裟z原蛋白富含甘氨酸、羥脯氨酸，普通的蛋白水解酶對(duì)其的水解能力弱?！舴N類多，不同生化試劑公司的產(chǎn)品種類、純度、酶活性都有一定差異?！粢话闩涑?0×貯備液，使用前作10倍稀釋2）pH調(diào)整液◆細(xì)胞生長(zhǎng)的最適pH為7.0～7.2，可耐受的pH范圍是6.6～7.8?！艉铣膳囵B(yǎng)液大多呈弱酸◆常用的調(diào)正液

NaHCO2；7.4%，5.6％，3.7％

HEPES:10-50mmol/L1NHCL10%HAC1NNaOH◆細(xì)胞培養(yǎng)液PH濃度的調(diào)節(jié)最常用的為加NaHCO3的方法，因?yàn)镹aHCO3可供CO2，但二氧化碳易于逸出，故最適用于封閉培養(yǎng)，◆羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）因其對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，也起緩沖作用，有防止PH迅速變動(dòng)的特性而用于開(kāi)放細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，其最大優(yōu)點(diǎn)是在開(kāi)放式培養(yǎng)或細(xì)胞觀察時(shí)能維持較恒定的PH值。

◆二氧化碳既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需成分，它在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的PH值?！舸蠖鄶?shù)細(xì)胞的適宜PH為7.2-7.4，偏離這一范圍對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響。但細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環(huán)境中更利于細(xì)胞生長(zhǎng)。有資料顯示，原代羊水細(xì)胞培養(yǎng)PH6.8時(shí)最適。3）抗菌素溶液：◆在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)?！舫Ｓ糜星嗝顾?、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、兩性霉素B等，常聯(lián)合使用。◆常配成100×或200×濃度，分裝，冷凍保存，使用前加入培養(yǎng)液中。抗生素液鏈霉素(100ug/ml)

青霉素(100單位/ml)

制霉菌素(100單位/ml)

終濃度不超過(guò)萬(wàn)分之一為宜抗生素濃度(量/ml）抗菌范圍貯存使用真菌細(xì)菌支原體青霉素G10000u100u＋＋＋＋＋＋鏈霉素10000μg100μg＋＋＋慶大霉素10000u

50u＋＋卡那霉素

5000μg

50μg＋＋＋多粘菌素

5000μg

50μg＋＋四環(huán)素

1000μg

10μg＋＋＋＋紅霉素

5000μg

50μg＋＋兩性霉素B

500μg

5μg＋＋＋＋制菌霉素

5000u

25μg＋＋＋＋金霉素10000μg

50μg

＋＋＋＋抗生素用量和抗菌范圍4）L-Glutamin溶液◆制備時(shí)取L-Glutamin（分子量146.15）6g，溶于三蒸水200ml中，濾過(guò)除菌，分裝，－20℃冰凍保存◆每100ml培養(yǎng)液中加1mlL-Glutamin溶液4.常用培養(yǎng)基◆培養(yǎng)是既是培養(yǎng)細(xì)胞中供給細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促使細(xì)胞生殖增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的生存環(huán)境。培養(yǎng)基的種類很多，◆按其物質(zhì)狀態(tài)分為半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類；◆按其來(lái)源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基（naturalmedia)：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來(lái)源受限，成分復(fù)雜，個(gè)體差異大影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染（1）

雞血漿的制備血漿含有纖維蛋白和一些營(yíng)養(yǎng)成分，與雞胚胎汁混合會(huì)發(fā)生凝固，構(gòu)成組織細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境，有利于細(xì)胞向三維空間生長(zhǎng)。制備為選擇1年左右體大、健壯的雄雞，禁食1天，從雞翅取血，混勻離心取上清，分裝，－20℃保存①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長(zhǎng)因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分（2）血清一般說(shuō)來(lái)．含5％小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死．但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加10％血清．對(duì)于血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對(duì)血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚．血清中不僅存在促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，同對(duì)也存在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56℃，30分鐘血清的消毒：過(guò)濾除菌3.水解乳蛋白（Lactalbumin

hydrolysate,LH）4.鼠尾膠原膠原是細(xì)胞生長(zhǎng)的良好基質(zhì)，尤其對(duì)組織塊和細(xì)胞的固定附著、改善生長(zhǎng)表面的特性有很好的作用。主要用于組織粘著培養(yǎng)及不易貼壁細(xì)胞的附著，并改善生長(zhǎng)表面的性質(zhì)以適合細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)自大鼠尾腱、豚鼠或牛的真皮、牛眼的晶狀體等，大鼠尾膠是最常用的合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培養(yǎng)基主要成