巴氏染色原理及操作步驟

PAGEPAGE5巴氏染色原理及操作步驟巴氏染色法是脫落細胞染色中最好的染色方法。蘇木素染液，細胞核內(nèi)的染色質(zhì)主要是去氧核糖核酸（DNA）,DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，兩條鏈上的磷酸基向外，帶負(fù)電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木素精堿性染料以離子或氫鍵結(jié)合而被染色。蘇木精在堿性溶液中呈藍色，所以細胞核被染成藍色。分化：蘇木素染色之后，用水洗去未結(jié)合在細胞上的染液，但是在細胞核中結(jié)合過多的染料和細胞漿中吸附的染料必須用分化液1%鹽酸酒精脫去，才能保證細胞核和細胞漿染色的分明，把這個過程稱為染色的分化作用。因酸能破壞蘇木素的醌型結(jié)構(gòu)，使色素與組織解離，分化不可過度。藍化：分化之后蘇木素在酸性條件下處于紅色離子狀態(tài)，在堿性條件下處于藍色離子狀態(tài)，而呈藍色，所以分化之后用水洗去酸而中止分化，再用弱堿性水使蘇木精染上的細胞核變呈藍色，稱藍化作用，一般多用自來水浸洗即可變藍，也可用溫水（50度溫水最佳）變藍。EA50染液的酸堿度對于巴氏染色的成功起著關(guān)鍵作用，EA50染液由伊紅、亮綠、等染料配成。伊紅、亮綠、橘黃等屬于酸性染料，在溶解媒中其發(fā)色團是負(fù)離子部分，發(fā)色團可與蛋白質(zhì)中帶正電的氨基結(jié)合，從而是胞漿顯藍色、綠色、橘黃色或紅色，但蛋白質(zhì)所帶正負(fù)電荷的多少是隨溶液的PH值而改變的，在偏堿環(huán)境中，蛋白質(zhì)的羧基游離增多（帶負(fù)電），在偏酸環(huán)境中蛋白質(zhì)氨基游離增多（帶正電），磷鎢酸在染色過程中，不但作為媒染劑可增加染料的著色力，同時磷鎢酸與碳酸鋰還是一對弱酸弱堿，實際上是一對緩沖劑，可中和分化及藍化時可能留下的少量酸或堿，保證染色達到理想效果，其適用于上皮細胞及間皮組織的標(biāo)本，是陰道脫落細胞檢查中最常用的染色方法，該染色法不但具有顯示細胞核結(jié)構(gòu)清晰、分色明顯、透明度好、胞漿受色鮮艷等特點。巴氏染色法將胞核染為深藍色；鱗狀上皮底層、中層及表層角化前細胞胞質(zhì)染綠色，表層不全角化細胞胞質(zhì)染粉紅色，完全角化細胞胞質(zhì)呈桔黃色；細菌：灰色；滴蟲：淡藍灰色；黏液：淡藍色或粉紅色；中性粒細胞和淋巴細胞、吞噬細胞胞質(zhì)均為藍色；紅細胞染粉紅色；高分化鱗癌細胞可染成粉紅色或桔黃色；腺癌胞質(zhì)呈灰藍色。巴氏染色的操作方法及注意事項染色有4個步驟：1、固定；2、核染色；3、胞漿染色；4、透明。主要達到以下要求：1、核的結(jié)構(gòu)清晰；2、透明度高；3、分色恰當(dāng)。一、固定固定的目的細胞制片的迅速固定是制片過程中關(guān)鍵的一步，否則會影響細胞學(xué)診斷的準(zhǔn)確性。對于不同的標(biāo)本需要不同的固定方法。最為常用的固定方法是95％酒精作為固定液的濕固定法。酒精作為一種脫水劑能夠防止細胞內(nèi)的酶捋蛋白質(zhì)分解而自容，并凝固細胞內(nèi)的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂肪和糖類等，使其保持與組織生活相仿的成分，從而使細胞各部分，尤其核染色質(zhì)易于著色。對于巴氏染色來說，酒精固定最為重要的。如果酒精濃度不足引起的固定不佳，可造成細胞的人為變化，并可導(dǎo)致假陽性或假陰性的診斷。1、固定方法濕固定法：作為用95％酒精固定液固定的細胞學(xué)標(biāo)本一定使用濕固定法。制片制備完后，趁標(biāo)本新鮮而又濕潤時，立即放入盛有95％酒精的固定缸內(nèi)。制片在固定液內(nèi)至少保持15-30min。固定時間通常不超過1周。這種制片染色后，顏色鮮艷，結(jié)構(gòu)清晰。如果細胞制片需要送至另一實驗室或郵寄他處染色時，可以固定15min后，把制片取出后立即密封的容器中或者使用甘油防止制片干燥。因為無論固定前或固定后的制片，如果發(fā)生干燥后都會影響染色的效果。2、固定注意事項固定液的過濾：為了防止細胞污染，凡是使用過的固定液，必須過濾后才能再使用。使用過長的固定液，必須用酒精相對密度計測定，酒精濃度低于90％時應(yīng)該及時更換新液。濕固定的重要性：標(biāo)本再新鮮時及時固定時保證染色效果的重要因素。如蘇木素對細胞核的染色，巴氏染色中胞漿的特殊著色作用，均可因標(biāo)本干燥后固定而大受