N-乙酰-L-半胱氨酸對大鼠胃缺血-再灌注損傷的影響（醫(yī)學論文）

1/1N-乙酰-L-半胱氨酸對大鼠胃缺血-再灌注損傷的影響（醫(yī)學論文）N-乙酰-L-半胱氨酸對大鼠胃缺血/再灌注損傷的影響【摘要】目的研究抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)對胃缺血/灌注(gastricischemia/reperfusion,GI/R)損傷的影響。

方法采用股靜脈注射NAC后，夾閉大鼠腹腔動脈30min，再灌注1h的GI/R模型，計數(shù)胃黏膜損傷指數(shù)(gastricmucosaldamageindex,GMDI)，測定胃黏膜組織中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性，RT-PCR法檢測凋亡相關因子環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達。

結果股靜脈注射NAC能降低GI/R胃黏膜損傷指數(shù)，使胃黏膜組織中MDA含量減少，SOD活性增強，凋亡相關因子COX-2的表達減少。

結論NAC對大鼠GI/R損傷具有保護作用，這種保護作用是通過抑制氧化應激，減少胃黏膜細胞凋亡而實現(xiàn)的。

【關鍵詞】N-乙酰-L-半胱氨胃缺血/再灌注胃黏膜損傷指數(shù)超氧化物歧化酶Abstract：

ObjectiveTostudytheeffectofantioxidantN-acetylcysteine(NAC)ongastricischemia/reperfusion(GI/R)inrats．MethodsAfterinjectionofNACintofemoralvein,theGI/Rmodelwasestablishedbyclampingtheceliacarteryfor30mintoinducedischemiaandallowingreperfusionfor1h.Theratswerefinallysacrificedtoinvestigategastricmucosaldamageindex(GMDI),determinethecontentofmalondialdehyde(MDA)andtheactivityofsuperoxidedismutase(SOD)ingastricmucosa.Theexpressionofapoptosis-relatedCOX-2wasdetectedbyRT-PCR.ResultsInjectionofNACintofemoralveincoulddecreasegastricmucosaldamageindex,reducethecontentofMDA,raisetheactivityofSODandinhibittheexpressionofCOX-2ingastricmucosafollowingGI/R.ConclusionNACcanprotectagainstGI/Rinjurybyinhibitingoxidativestressandreducingcellapoptosisingastricmucosa.Keywords：

N-acetylcysteine;gastricischemia/reperfusion；gastricmucosaldamageindex；superoxidedismutase器官缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)時，由于機體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，氧自由基(reactiveoxygenspecies,ROS)產(chǎn)生增多，在體內(nèi)蓄積過多，使器官組織的細胞膜脂質(zhì)過氧化，從而造成損傷［1］。

采用抗氧化劑防治器官I/R損傷已經(jīng)受到了人們的重視。

N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)是一種抗氧化劑，作為谷胱甘肽(glutathione,GSH)的前體物質(zhì)，可以減輕I/R造成的機體損傷［2］。

但是NAC對GI/R損傷的影響及其可能的機制，目前尚未見報道。

因此，本實驗主要采用股靜脈給予NAC后，觀察對大鼠胃缺血/再灌注（gastricischemia/reperfusion,GI/R）損傷的影響，測定胃黏膜組織中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性變化及凋亡相關因子環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達，并對其機制進行了初步的探討。

1材料和方法1.1實驗藥物和試劑NAC購自Sigma公司，SOD和MDA試劑盒購自南京建成生物研究所，cDNA鏈合成試劑盒和PCR擴增試劑盒購自上海天根生物有限公司，PCR引物購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2實驗動物和分組成年雄性健康SD大鼠，體重250～300g，由徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供。

實驗前禁食24h，自由飲水。

實驗動物隨機分為假手術組（sham組）、胃缺血/再灌注組（GI/R組）、NAC+GI/R組（NAC組），每組6只。

1.3GI/R模型和樣本制備實驗時動物以10%的水合氯醛(300mg/kg,ip）麻醉，在股靜脈給予NAC（150mg/kg）后，按我實驗室方法［3］，開腹,分離并夾閉腹腔動脈30min,去除動脈夾恢復血流。

于再灌注后1h處死動物，快速取胃，沿胃大彎剪開，1%冷PBS液沖洗干凈，置于冰上展開，計數(shù)胃黏膜損傷指數(shù)（GMDI）后，留取胃黏膜標本：

剪取一側胃黏膜于5mlEP管中，低溫勻漿分別制成10%和1%的組織勻漿液，置于-20℃冰箱待測SOD、MDA；剪取另一側胃黏膜于5ml無核酶EP管中，置于-80℃冰箱待測COX-2。

1.4胃黏膜損傷指數(shù)的測定按我實驗室方法［4］:以胃腺區(qū)局限于胃上皮的點狀糜爛、潰瘍、出血灶的長度累積計分：

正常為0分，損傷lt;1mm計1分，gt;1mm并且2mm計2分，gt;2mm并且3mm計3分，余類推。

損傷寬度超過1mm時分數(shù)加倍。

每組大鼠損傷分數(shù)的平均值為損傷指數(shù)。

1.5MDA含量和SOD活性的測定分別采用硫代巴比妥(TAB)法和黃嘌呤氧化酶法，按照試劑盒中說明書的步驟操作。

1.6凋亡相關因子COX-2表達測定采用RT-PCR法，嚴格按試劑盒中說明書的步驟提取胃黏膜組織中的RNA和配置反應體系。

COX-2(254bp)：

上游引物5-GCTTCGGGAGCAC-AACAGAG-3,下游引物5-TCAGCGGATGCCAGTGATAGA-3。

-actin(217bp)：

上游引物5-TGTCCCTGTATGCCTCTGGT-3,下游引物5-TTGATGTCACGCACGATTTC-3。

COX-2和-actin的反應條件為：

94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30個循環(huán)，72℃5min終末延伸，4℃終止反應。

取擴增的cDNA產(chǎn)物9l于1%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析成像，各組COX-2片段與-actin片段的平均光密度（D）比值作為COX-2mRNA的相對量，并進行比較。

1.7統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)以s表示，組間比較采用t檢驗，Plt;0.05有統(tǒng)計學意義。

2結果2.1NAC對大鼠GI/R胃黏膜損傷、胃黏膜組織中MDA含量及SOD活性的影響GI/R組GMDI明顯高于sham組（Plt;0.01），NAC組GMDI高于sham組（Plt;0.05）；NAC組GMDI低于GI/R組（Plt;0.05）。

GI/R組MDA含量明顯高于sham組（Plt;0.01），NAC組MDA高于sham組（Plt;0.05）；NAC組MDA含量低于GI/R組（Plt;0.05）。

GI/R組SOD活性明顯低于sham組（Plt;0.01），NAC組SOD活性低于sham組（Plt;0.05）；NAC組SOD活性高于GI/R組（Plt;0.05）。

見表1。

2.2NAC對GI/R大鼠胃黏膜組織中COX-2表達的影響RT-PCR結果顯示：

GI/R組COX-2的表達明顯高于sham組（Plt;0.01），NAC組COX-2的表達高于sham組（Plt;0.05），NAC組COX-2的表達低于GI/R組（Plt;0.05）（表2，圖1）。

表1NAC對GI/R胃黏膜損傷、胃黏膜組織中MDA含量及SOD活性的影響表2NAC對GI/R大鼠胃黏膜組織中COX-2表達的影響3討論器官I/R損傷是由于再灌注恢復血流時，ROS生成增多，機體抗氧化能力減弱，進而損傷線粒體，使脂質(zhì)代謝障礙，并且激活與凋亡相關的信號通路，使I/R組織細胞凋亡增多從而導致組織器官的損傷［5-6］。

因此，治療器官I/R損傷應從抗氧化方面著手，提高機體的抗氧化能力，減少ROS生成，抑制凋亡信號通路的激活是防治I/R損傷的關鍵。

有研究報道，NAC作為一種抗氧化劑可以對抗氧自由基對I/R組織的損傷，此外，NAC還可以抑制多種凋亡相關信號通路的激活，減少細胞凋亡。

在心肌再灌注損傷中，NAC可以減少再灌注時ROS的生成，促進ROS清除，同時，NAC還可抑制氧化應激時多種凋亡相關因子和凋亡信號通路的激活，減少心肌I/R時細胞的凋亡［7-11］。

NAC可以增加腦I/R時組織細胞的抗氧化性，減少ROS的生成。

同時，抑制凋亡信號通路的激活，減少氧化應激時腦細胞的凋亡［12］。

綜上所述，NAC可以增加I/R損傷時組織細胞的抗氧化性，減少氧化應激早期ROS生成，促進ROS清除，減輕組織損傷。

此外，NAC可以抑制氧化應激時凋亡相關信號通路的激活，抑制細胞凋亡，減輕組織細胞的損傷。

然而NAC是否可以減輕大鼠GI/R損傷？及其相關機制如何？這是我們感興趣的問題。

本實驗發(fā)現(xiàn)：

股靜脈給予NAC可以使GI/R大鼠胃黏膜組織中的MDA含量減少，SOD活性增加，提高胃黏膜組織的抗氧化性，減輕胃黏膜損傷。

同時，NAC還可以抑制凋亡相關因子COX-2表達，這可能與抑制GI/R損傷時凋亡相關信號通路的激活有關，使胃黏膜細胞凋亡減少，減輕GI/R損傷。

因此我們認為，NAC對大鼠GI/R損傷具有保護作用，其保護作用與抗氧化和抑制細胞凋亡有關，涉及到的具體信號通路，將在以后的實驗中繼續(xù)探討。

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