MRPS5 對膀胱癌細胞增殖能力及干性特征的影響

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huangqingyuan@EffectsofMRPS5onproliferationabilityandstemnessofbladdercancercellsLiuQiliang1,LiuLimei2,LiuChungang2,QianCheng2,HuangQingyuan1(1DepartmentofHighaltitudeMilitaryMedicine,PathophysiologyandHighaltitudepathology,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing,400038,China;2DepartmentofPathology,SouthWestHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing,400038,China)[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheeffectsofmitochondrialribosomalproteinS5（MRPS5）onhumanbladdercancercellsproliferationabilityandstemnessfeaturesofthebladdercancerstemcells.MethodsExpressionofMRPS5proteinwithinseveralpairedhumanbladdercancerandadjacentnormaltissueswasdetectedbywesternblot;InterferencelentiviralvectortargetingMRPS5wasconstructedtoinfectthebladdercancercelllineT24andalentiviralvectorwithScramblesequencewasusedascontrol.TheexpressionofMRPS5proteinwasdetectedbywesternblottoensuretheinterferenceeffiency;cellsproliferationabilitywasdetectedbycellviabilityassay;cellcyclewasmeasuredbyflowcytometry;sphereformingabilitywasobservedbysphereformationexperiment;expressionofcancerstemcellrelatedtranscriptionfactorsNanog,Oct4,c-MycandSox2proteinweredetectedbywesternblot;NOD/SCIDmicesubcutaneoustransplantationtumorexperimentwasusedtoreflectin-vivotumorigenicability.ResultsTheexpressionofMRPS5proteinwithinbladdercancertissueswashigherthanadjacentnormaltissuesinmajority.InterferencelentiviralvectorPLKO.1-shMRPS5waseffectiveandwiththeexpressionofMRPS5wasinterfered,theT24cellproliferationabilitywasdecreased(P0.05),thecellcyclewasarrestedinSphase,theexpressionofNanog,Oct4,c-MycandSox2proteinwerealldecreased,thesphereformationefficiencywasnotchanged(P0.05)butspheresizesweresignificantlydecreased;inaddition,thevolumeandweightofmousetransplantedtumorswerebothdecreased:volume[(0.7840.278)vs(0.5000.245)cm3,(P0.05)],andweight[(0.8620.372)vs(0.4120.248)g,(P0.05)].ConclusionMRPS5proteinwasexpressedhighinbladdercancertissuesandwhenMRPS5proteinexpressionwasreduceditcoulddecreaseT24cellsproliferationabilityandthestemcellswithinT24.[Keywords]bladdercancer;mitochondrialribosomalproteinS5(MRPS5);proli-feration;cancerstemcellCorrespondingauthor:QianCheng,Tel:86-23-68765957,E-mail:cqian8634@；HuangQingyuan,Tel:86-23-68752391,E-mail:huangqingyuan@膀胱癌發(fā)病率較高，占泌尿系腫瘤近90%以上[1,2]。

其發(fā)病機制不詳，可能涉及到癌基因激活和抑癌基因失活[3]。

臨床根治性膀胱切除術仍是膀胱癌治療的主要治療方式，但術后病人生活質量極度下降，且術后復發(fā)率高，5年生存率僅50%左右[4,5]。

因此，發(fā)現(xiàn)利于臨床診斷、治療、預后評估的分子標志顯得尤為重要。

機體衰老是腫瘤發(fā)生的易感因素，研究證實長壽相關基因參與調控這種易感性，如線蟲長壽相關基因Sir2、daf-2、lin2、dct2、nnt-1等既能調控壽命，也能促進腫瘤細胞的增殖或凋亡，而它們在哺乳動物都有相應的同源基因[6-9]。

同時腫瘤細胞線粒體DNA突變率高，諸如線粒體Cytb、ND6等基因突變甚至能促進腫瘤細胞演進，因此線粒體DNA突變所致的線粒體功能障礙已成為腫瘤細胞重要特點之一[10-12]。

最新研究發(fā)現(xiàn)線粒體核糖體蛋白S5（mitochondrialribosomalproteinS5，MRPS5）基因通過線粒體代謝機能障礙途徑調控線蟲及小鼠的壽命，而且MRPS5作為線粒體核糖體28S小亞基成員，與線粒體能量代謝相關，我們由此推測腫瘤中MRPS5也可能發(fā)生功能改變進而調控腫瘤生物學功能。

關于其在膀胱癌中的作用尚無報道，本實驗將探討其對膀胱癌細胞增殖及干性特征的影響。

1.材料與方法1.1實驗材料人膀胱癌及癌旁組織由第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院泌尿外科張恒收集。

NOD/SCID小鼠購于重慶騰鑫生物技術公司并飼養(yǎng)于第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院實驗動物中心。

人膀胱癌T24細胞由我室保存。

RPMI1640培養(yǎng)基，胎牛血清，胰酶等細胞培養(yǎng)相關試劑購自Gibco公司。

兔抗人MRPS5，Nanog，Oct4抗體購自abcam公司，兔抗人GAPDH，Sox2抗體購自CellSignaling公司，小鼠抗人c-Myc抗體購自SantaCruz公司。

CellTiter-BlueCellViabilityAssay試劑盒購自Promega公司。

細胞周期檢測試劑盒購自碧云天公司。

分子克隆試劑及慢病毒包裝質粒等主要由本室保存。

BBG16UV151L二氧化碳培養(yǎng)箱及CKX41-A32PH倒置相差顯微鏡等分別購自Thermo，Olympus公司，流式細胞儀、VarioskanFlash多功能酶標儀由第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院公共實驗平臺提供。

1.2主要方法1.2.1細胞培養(yǎng)T24細胞培養(yǎng)于10%胎牛血清RPMI1640（含青、鏈霉素）培養(yǎng)基中，在溫度為37℃，5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中孵育，細胞密度達80％-90％進行傳代。

實驗采用對數(shù)期長勢良好的細胞。

成球培養(yǎng)基為DMEM/F12，含20ng/mlEGF、20ng/mlbFGF、20mg/mlB27、1%甲基纖維素。

培養(yǎng)條件同前。

1.2.2慢病毒干擾載體感染T24細胞按分子克隆技術制備靶向干擾MRPS5的載體PLKO.1-shMRPS5及對照載體PLKO.1-shScramble，進行慢病毒包裝后收集病毒液分裝儲存于-80℃。

細胞分為PLKO.1-shMRPS5實驗組及PLKO.1-shScramble對照組。

感染前細胞接種于六孔板內，待融合度達40%時分別加病毒液感染16小時，再換液后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3WesternBlot病毒感染72小時后裂解細胞提取總蛋白，煮沸變性后行SDS電泳，濕轉到NC膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2小時后，一抗4度過夜，PBST洗滌，二抗室溫孵育1小時，PBST洗滌后顯影拍照。

MRPS5表達用于檢測病毒干擾效率。

Nanog、Oct4、c-Myc、Sox2抗體用于反映腫瘤干性轉錄因子[13,14]的表達。

人膀胱癌及癌旁組織經(jīng)裂解后檢測MRPS5的差異表達。

GAPDH作為內參。

結果重復3次。

1.2.4細胞增殖能力檢測分別收集感染近60小時的T24細胞，流式細胞儀計數(shù)（排除7-AAD陽性死細胞）后鋪96孔板。

每孔100ul培養(yǎng)基，各含1000個活細胞。

鋪板后第二天起檢測細胞活力（計為第1天）。

按照CellTiter-BlueCellViabilityAssay試劑說明操作。

實驗重復3次。

1.2.5細胞周期檢測分別收集病毒感染72小時的細胞，PBS洗，70%乙醇4度固定過夜，按照周期檢測試劑說明行PI染色后流式488nm波長檢測。

實驗重復3次。

1.2.6成球實驗感染72小時的T24細胞，經(jīng)流式細胞儀計數(shù)（排除7-AAD陽性的死細胞）后鋪超低黏附96孔板。

每孔100ul成球培養(yǎng)基，含10個活細胞，各鋪10個復孔。

靜置培養(yǎng)14天后倒置顯微鏡下觀察成球率（每孔細胞球數(shù)目總和／每孔加入的細胞數(shù)100％）及直徑，并拍照。

1.2.7小鼠體內成瘤實驗10只5周齡雄性NOD/SCID小鼠，體重約16g-18g，隨機均分為PLKO.1-shMRPS5實驗組及PLKO.1-shScramble對照組。

將分別經(jīng)病毒感染72小時后的T24細胞傳代擴大培養(yǎng)后，分別用無菌PBS制成單細胞懸液并計數(shù)。

實驗組每只小鼠雙側背部皮下各注射5106實驗組細胞，對照組則注射相同數(shù)目對照組細胞。

待小鼠皮下成瘤后每2天記錄移植瘤體積（腫瘤體積=短徑長徑0.52），第6周末處死小鼠并取出移植瘤，拍照并稱重。

1.2.8統(tǒng)計學處理計量資料以xs表示，采用SPSS13.0行兩獨立樣本t檢驗。

2結果2.1臨床組織標本檢測MRPS5差異表達臨床收集的12對膀胱癌及癌旁正常組織裂解提蛋白，行westernblot，結果顯示（圖1），8對癌組織中（66.7%）MRPS5表達高于癌旁組織。

a:膀胱癌癌旁正常組織；b：

膀胱癌組織圖1westernblot檢測12對膀胱癌及癌旁組織MRPS5表達2.2慢病毒感染T24細胞慢病毒PLKO.1-shMRPS5（實驗組）感染T24細胞72小時后，westernblot檢測MRPS5蛋白變化，結果顯示同PLKO.1-shScramble（對照組）相比，MRPS5表達降低（圖2）。

表明構建的干擾載體有效。

圖2westernblot檢測MRPS5的干擾效率2.3干擾MRPS5使T24細胞增殖能力下降慢病毒PLKO.1-shMRPS5（實驗組）及PLKO.1-shScramble（對照組）分別感染T24細胞60小時后，流式鋪板，第二天起按試劑說明連續(xù)5天檢測細胞生長曲線，與對照組相比，干擾MRPS5后細胞增殖能力下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05，P0.01，圖3）。

a:P0.01,b:P0.05，兩組相比圖3干擾MRPS5對T24細胞生長的影響2.4干擾MRPS5改變T24細胞周期慢病毒PLKO.1-shMRPS5及PLKO.1-shScramble分別感染T24細胞，72小時后收集細胞進行PI單染流式檢測，結果顯示干擾MRPS5后S期細胞明顯增多（圖4），提示干擾MRPS5后細胞可阻滯于S期。

○A○B(yǎng)A：

PLKO.1-shScramble對照組；B：

PLKO.1-shMRPS5實驗組圖4干擾MRPS5對T24細胞周期的影響2.5干擾MRPS5抑制T24細胞中的干細胞生物學特征PLKO.1-shMRPS5（實驗組）及PLKO.1-shScramble（對照組）病毒分別感染T24細胞，行成球實驗及westernblot。

數(shù)據(jù)顯示實驗組平均成球率（0.0500.053）與對照組平均成球率（0.0600.052）相比無差異（P0.05），但同高倍鏡下實驗組成球直徑明顯減小（圖5）；同時，與腫瘤干細胞干性特征相關的部分轉錄因子Nanog，Oct4，c-Myc，Sox2表達也下調。

由此可見，干擾MRPS5可以減弱T24中的干細胞的干性特征。

○A○B(yǎng)A：

成球實驗（倒置顯微鏡200）；B：

westernblot檢測干性轉錄因子表達圖5干擾MRPS5對T24細胞干性特征的影響2.6干擾MRPS5抑制小鼠體內成瘤能力PLKO.1-shScramble（對照組）及PLKO.1-shMRPS5（實驗組）小鼠均成瘤10個。

對照組瘤體平均體積[(0.7840.278)cm3]大于干擾組[(0.5000.245)cm3]（P0.05，圖6），且對照組瘤體平均重量[(0.8620.372)g]較干擾組[(0.4120.248)g]重（P0.05，圖6）。

圖6干擾MRPS5對小鼠成瘤能力的影響3討論膀胱癌是最常見的泌尿系惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展機制十分復雜，主要涉及c-Myc、h-ras、EGFR等癌基因的激活，以及p21、p53、Rb、p16ink4a/p19ink4b等抑癌基因的失活[3,15]。

但最近研究發(fā)現(xiàn)除了經(jīng)典的癌基因及抑癌基因，一些參與線粒體能量代謝的關鍵蛋白，如細胞色素B（Cytb）、丙酮酸脫氫酶激酶1（PDK1）、異檸檬酸脫氫酶1/2（IDH1/2）、延胡索酸水化酶（FH）、琥珀酸脫氫酶（SDH）等基因的突變也能參與正常細胞的惡性轉化并促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10,16-18]。

MRPS5作為線粒體核糖體蛋白28S小亞基成員，其主要作用是參與合成線粒體有氧呼吸鏈的部分蛋白，與機體能量代謝有關，因此幾乎廣泛分布于各組織器官。

近期研究表明，MRPS5能調控線蟲及小鼠的壽命，而機體的衰老與腫瘤發(fā)生易感性具有相關性[8]。

并且已鑒定的多種壽命相關基因同時扮演著癌基因或抑癌基因的角色，這提示我們MRPS5可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

本課題合作組成員前期發(fā)現(xiàn)在人肝癌組織中MRPS5表達明顯高于正常組織（未發(fā)表），且本研究通過對12對人膀胱癌及癌旁組織MRPS5表達的檢測也發(fā)現(xiàn)存在這種差異，提示MRPS5在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

而針對MRPS5對某一腫瘤細胞生物學功能的研究較少，其是否影響膀胱癌細胞增殖、干性能力等也不清。

本研究結果顯示，慢病毒干擾載體PLKO.1-shMRPS5能顯著降低MRPS5表達，且干擾MRPS5后膀胱癌T24細胞的增殖能力下降，其一方面機制可能是通過抑制細胞周期轉換，使周期阻滯于S期。

同時，干擾MRPS5不改變T24細胞平均成球率但減小成球體積，同時降低腫瘤干細胞相關轉錄因子Nanog，Oct4，c-Myc，Sox2的表達，而腫瘤干細胞理論認為腫瘤中存在一小群具自我更新和分化潛能的細胞，它們參與腫瘤的起始，生長，侵襲轉移，復發(fā)等[14,19]。

因此提示MRPS5可影響膀胱癌細胞中的干細胞的干性能力，但遺憾的是尚沒有可靠的分子標志以探討MRPS5對T24中干細胞干性表型的影響。

進一步通過NOD/SCID小鼠皮下成瘤實驗證實干擾MRPS5能抑制小鼠的成瘤能力，使成瘤體積減少重量減輕。

綜上可知MRPS5能促進膀胱癌細胞增殖能力及干性特征，可能在膀胱癌中扮演類似癌基因的角色。

除此之外，我們也證實MRPS5并不影響T24細胞的遷移能力。

從MRPS5作為線粒體代謝調控因子角度看，腫瘤作為代謝性疾病，其發(fā)生發(fā)展與線粒體代謝性功能紊亂有關，而MRPS5功能突變只是部分事件，或許正是在腫瘤微環(huán)境的適應過程中MRPS5發(fā)生了這些功能性改變。

有關MRPS5對膀胱癌細胞能量代謝如ATP、乳酸、活性氧的影響亟待深入研究，這將幫助我們了解MRPS5代謝性調控膀胱癌細胞功能的相關機制。

綜上所述，本研究初步證實了MRPS5在膀胱癌細胞中的部分生物學作用，有關其更多功能及分子機制需后續(xù)進一步研究。

這也許能為膀胱癌的診斷、治療及預后提供可靠的分子標志。

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