蛋白質(zhì)表達和抗體制備

關(guān)于蛋白質(zhì)表達和抗體制備常用蛋白表達系統(tǒng)(host)

原核：大腸桿菌。真核：酵母、昆蟲、哺乳動物、植物。第2頁,共32頁，星期六，2024年，5月大腸桿菌表達系統(tǒng)大腸桿菌是基因工程研究中采用最多的原核表達體系。優(yōu)越性：①對大腸桿菌的基礎生物學、分子遺傳學等背景知識和基因表達的調(diào)控機理已有了深刻了解；②商品化的載體和菌株種類非常齊全；③表達效率高；④易培養(yǎng)，成本低。缺點：①因分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體；②蛋白質(zhì)不能糖基化；③其內(nèi)毒素很難除去。

第3頁,共32頁，星期六，2024年，5月酵母表達系統(tǒng)優(yōu)越性：①蛋白可糖基化，有相對正確的天然結(jié)構(gòu)，可很好的生產(chǎn)分泌型蛋白；②表達載體為整合型質(zhì)粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中，實現(xiàn)高效率表達；③表達載體都為E.coli/PichiaPastoris的穿梭載體，可在獲得克隆后采用E.coli細胞大量擴增。④易培養(yǎng)，成本低,可高密度發(fā)酵。缺點：①糖基化與哺乳動物有所差別；②培養(yǎng)上清多糖濃度高，不利于純化。第4頁,共32頁，星期六，2024年，5月昆蟲細胞表達系統(tǒng)利用重組桿狀病毒在昆蟲細胞體系中表達外源蛋白是目前較為流行的表達方式。優(yōu)越性：①重組蛋白具有完整的生物學功能，如蛋白的正確折疊、二硫鍵的搭配；②可容納較大片段的外源DNA插入，因此是表達大片段DNA的理想載體；③可進行分泌表達。缺點：①糖基化與哺乳動物有所差別；②表達量有限；③作為藥物宿主細胞未被FDA認可；

④培養(yǎng)成本高。第5頁,共32頁，星期六，2024年，5月哺乳動物細胞表達系統(tǒng)哺乳動物細胞常用于表達高活性的人源重組蛋白。優(yōu)越性：①糖基化與人源蛋白一致；②能表達天然結(jié)構(gòu)的完整蛋白，活性很高；③可進行分泌表達。缺點：①表達量低；②培養(yǎng)成本很高，操作繁瑣。第6頁,共32頁，星期六，2024年，5月植物表達系統(tǒng)優(yōu)越性：①能夠表達來自動物、細菌、病毒以及植物本身的蛋白質(zhì)。②易于大規(guī)模培養(yǎng)和生產(chǎn)。③在基因表達與修飾及安全性方面有特別的優(yōu)勢。缺點：不易提取與純化第7頁,共32頁，星期六，2024年，5月

FactorsinE.coli

proteinexpression

VectorStrainGrowthconditions第8頁,共32頁，星期六，2024年，5月原核表達載體眾多，常用的有pET(T7promoter)、pQE(T5promoter)、pGEX(GST融合表達)等。各載體適應的菌株也不盡相同pET(BL21(DE3))、pQE(M15,JM109)、pGEX(BL21)。對于我們來說，最常用和最需掌握的是pET表達系統(tǒng)表達載體(Vector)

第9頁,共32頁，星期六，2024年，5月Expressionplasmidfeatures第10頁,共32頁，星期六，2024年，5月Lacoperon第11頁,共32頁，星期六，2024年，5月Inductionofexpression第12頁,共32頁，星期六，2024年，5月原核表達宿主菌名稱特征用途抗性DH5α帶有recAendA突變的克隆菌株，由于DH5α具有deoR變異，可以作為較大質(zhì)粒的宿主菌使用。常用的質(zhì)粒抽提工程菌株,可用于藍白斑篩選鑒別重組菌株。無BL21lon和ompT蛋白酶缺陷型用于PGEX載體構(gòu)建質(zhì)粒的蛋白表達無BL21(DE3)lon和ompT蛋白酶缺陷型，含有l(wèi)acI抑制基因和位于lacUV5啟動子下的T7RNA聚合酶基因用于含有T7的pET系列載體構(gòu)建質(zhì)粒的蛋白表達無BL21(DE3)-RP在BL21(DE3)細胞的基礎上，具有額外拷貝的argU和proL基因解決了表達富含AT的基因組蛋白密碼子偏倚性問題氯霉素BL21(DE3)-RIL在BL21(DE3)細胞的基礎上，具有額外拷貝的argU、ileY和leuWtRNA基因解決了表達富含AT的基因組蛋白密碼子偏倚性問題氯霉素BL21(DE3)-plysS帶有可以與pET共存的、編碼T7溶菌酶（T7RNA聚合酶的天然抑制物）的質(zhì)粒。pLysS菌株在被誘導前T7RNA聚合酶的基礎表達被抑制，這樣可以使表達會影響宿主細胞生長和活力的重組體在宿主中更穩(wěn)定。帶有pLacI質(zhì)粒的宿主菌產(chǎn)生額外的抑制pETBlue和pTriEx載體基礎表達的lac阻遏蛋白更嚴格的本底表達控制，適合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表達。氯霉素BL21(DE3)-Rosetta-gami（Rosetta-gami）攜帶pRARE2質(zhì)粒的BL21衍生菌，補充大腸桿菌缺乏的七種（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA及CGG）稀有密碼子對應的tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達水平，又具有thioredoxinreductase(trxB)和glutathionereductase(gor)兩條主要還原途徑雙突變菌株，顯著提高細胞中二硫鍵形成幾率，促進蛋白可溶性及活性表達補充7種稀有密碼子，促進蛋白可溶性及表達活性卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素Rosetta-Blue帶有recAendAlacIq突變的克隆菌株,高蛋白表達,補充大腸桿菌缺乏的AGG,AGA,AUA,CUA,CCC,GGA六種稀有密碼子對應的tRNA。補充稀有密碼子，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達水平氯霉素第13頁,共32頁，星期六，2024年，5月所有B型菌株，B834，BL21，BLR，OrigamiB，Rosetta及Tuner都缺乏純化過程中降解蛋白的lon蛋白酶及ompT

外膜蛋白酶。因此，目的蛋白在這些菌株中的穩(wěn)定性要高于帶有這些蛋白酶的菌株。BL21(DE3)是用得最多的表達菌AD494(DE3)和BL21trxB(DE3)具有trxB突變，而Origami(DE3)，OrigamiB(DE3)和Rosetta-gami(DE3)菌株帶有trxB和gor雙突變。擁有trxB和gor突變的菌株比單具

trxB突變的菌株更有可能促進二硫鍵的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高多數(shù)氨基酸有不只一個密碼子，而不同的生物使用這61種密碼子的偏好性不同。每種細胞里，tRNA種類和數(shù)量直接反映了其mRNA使用密碼子的種類和數(shù)量的偏好性。當外源目的基因mRNA在E.coli里過表達，由于密碼子偏愛性不同，會因為缺乏某種或某幾種tRNA，直接導致翻譯終止或錯誤。tRNA不足會造成翻譯停頓，早期翻譯停止，移碼突變，和氨基酸錯摻等問題。Rosetta菌株是經(jīng)過修飾，專用于帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白表達的菌株。經(jīng)提高稀有tRNA水平，這些蛋白的表達會大幅度提高。第14頁,共32頁，星期六，2024年，5月

表達條件培養(yǎng)基抗生素誘導劑誘導溫度誘導時機誘導時間第15頁,共32頁，星期六，2024年，5月載體對表達的影響pET32,BL21(DE3),表達蛋白:Trx-His6-EK-IFN(MW35KD)pET43,BL21(DE3),表達蛋白:Nus-His6-STag-EK-IFN(MW78KD)NIIIMIpspsMNISPU:UninducedcrudeextractI:CrudeextractafterinducedS:LysissupertanantP:Lysisprecipitation第16頁,共32頁，星期六，2024年，5月0.1mMIPTG,incubatefor16hat16℃0.1mMIPTG,incubatefor3hat37℃

NISP

NISP表達條件對表達的影響pET21,BL21(DE3)-RIL,表達的蛋白:His6-REIIBP(MW67KD)U:UninducedcrudeextractI:CrudeextractafterinducedS:LysissupertanantP:Lysisprecipitation第17頁,共32頁，星期六，2024年，5月

增加可溶性和折疊降低蛋白合成速率。溫度。裂解緩沖液的性質(zhì)。融合標簽二硫鍵第18頁,共32頁，星期六，2024年，5月pET載體E.coli表達蛋白流程制備pET載體制備插入DNA將插入片段插入到pET載體上轉(zhuǎn)化表達宿主菌誘導/優(yōu)化表達目的蛋白放大實驗純化目的蛋白第19頁,共32頁，星期六，2024年，5月蛋白抗體制備

第20頁,共32頁，星期六，2024年，5月多克隆抗體：由某一抗原刺激機體后產(chǎn)生的抗體，實際上為針對該抗原分子表面不同抗原決定簇的抗體的混合物，即多克隆抗體。單克隆抗體：由單一B細胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體，稱為單克隆抗體。通常采用雜交瘤技術(shù)來制備，雜交瘤（hybridoma）抗體技術(shù)是在細胞融合技術(shù)的基礎上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細胞融合為B細胞雜交瘤。用具備這種特性的單個雜交瘤細胞培養(yǎng)成細胞群，可制備針對一種抗原表位的特異性抗體即單克隆抗體。第21頁,共32頁，星期六，2024年，5月?lián)墨I及DNAstar軟件分析，確定各蛋白最可能抗原區(qū)序列，PrimerPremier5.0軟件設計引物，從基因組，擴增目的基因?？寺≈羛ET28a載體上。轉(zhuǎn)化至DH5a中，經(jīng)PCR驗證重組子。重組子質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)菌株中，進行小量誘導表達，確認最適條件后，進行大量誘導表達，提取大腸桿菌包涵體，溶菌酶處理，添加去垢劑，超聲破碎后，溶于8MUrea中，經(jīng)鎳柱層析咪唑洗脫，過夜透析，無菌過濾后，免疫家兔，通過化學發(fā)光Western印跡確定多克隆抗血清的效價。第22頁,共32頁，星期六，2024年，5月抗原基因構(gòu)筑：通過設計的抗原序列aa的個數(shù)，加上載體上含組氨酸標簽序列的42aa，計算是否達到抗體注射免疫家兔的要求（17-25kDa之間）第23頁,共32頁，星期六，2024年，5月誘導表達靶蛋白：PCR驗證基因產(chǎn)物是否插入載體。轉(zhuǎn)化至DH5a中測序，再轉(zhuǎn)化至BL21中小量誘導表達各蛋白。探索蛋白表達最合適的條件，如溫度、誘導時間、IPTG濃度。0h2h4h6h第24頁,共32頁，星期六，2024年，5月大量誘導表達，分離包涵體：過夜培養(yǎng)25ml菌液，在5：1的錐形瓶:培養(yǎng)基中按1：50比例加入過夜菌液，30-35℃，0.4mMIPTG，按上述優(yōu)化條件大量誘導表達靶蛋白。5000g,15min,棄上清，加入Bindingbuffer(-Urea,20mMPBS(pH7.8),500mMNaCl)懸浮菌液。加入lysozyme（溶菌酶）至終濃度1mg/ml，室溫放置30min。加入1%Triton-X-100，冰中放置10min。超聲破碎120W，4s，間隔4s,5min。上清另存用于檢測。用Bindingbuffer(-Urea)懸浮洗滌可溶性雜蛋白。上清另存用于檢測。沉淀用Bindingbuffer(+8MUrea)懸浮。取少量上清檢測。其于凍存用于純化。control第25頁,共32頁，星期六，2024年，5月靶蛋白純化:0.45um濾器(whatman)去除細菌蛋白碎片，以利于進行組氨酸標簽表達蛋白的鎳柱層析純化。對蛋白進行定量（牛血清白蛋白法）。第26頁,共32頁，星期六，2024年，5月鎳柱層析:層析柱（(Poly-PrepChromatographyColumn,BIORAD)中加入1.5ml50%Ni-NTAHisBindResin，自然沉降，無菌水沖洗，3mlbindingbuffer(+8MUrea)平衡。（流速10ml/h）6ml（至少3ml）bindingbuffer(+8mUrea)洗柱，4mlwashingbuffer((20mMPBS,pH6.0,500mMNaCl,8MUrea)洗柱。6ml10mM(bindingbuffer+),50mM,100mM,150mM,200mMbuffer依次洗柱，洗脫靶蛋白。5ml無菌水沖洗。3mlBindingbuffer(+8MUrea)平衡。保留2mlBindingbuffer(+8MUrea)于柱中，保存于4℃。層析后蛋白樣品需經(jīng)過透析使Urea濃度8M降至2M，和中性條件(pH7.2,PBS)原理：His標簽是蛋白質(zhì)重組技術(shù)中經(jīng)常用到的一種標簽，其序列為六個組氨酸HHHHHH，其特點是分子量小，基本不改變蛋白質(zhì)的生物結(jié)構(gòu)，不改變蛋白質(zhì)的溶解性，更重要的是它使蛋白質(zhì)的純化變得極為方便，根據(jù)組氨酸上的咪唑環(huán)可以與二價金屬離子結(jié)合的原理，人們可以利金屬離子親和層析技術(shù)純化帶有His標簽的蛋白，即將含有目的蛋白的裂解