etv1在胃腸道間質(zhì)瘤中的特異性表達(dá)

1/1etv1在胃腸道間質(zhì)瘤中的特異性表達(dá)ETV1在胃腸道間質(zhì)瘤中的特異性表達(dá)【摘要】目的：

探討ETV1在胃腸道間質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及臨床意義。

方法：

應(yīng)用免疫組化、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western-blot檢測ETV1在135例不同胃腸道間質(zhì)瘤患者的腫瘤組織及瘤旁組織中的表達(dá)。

結(jié)果：

免疫組化結(jié)果顯示，ETV1在胃腸道間質(zhì)瘤中陽性表達(dá)率為68.1%，顯著高于瘤旁正常組織的5.2%（P0.05）。

熒光定量PCR方法顯示，間質(zhì)瘤組織中ETV1的相對表達(dá)Ct值（3.302.37）低于瘤旁正常組織的（6.192.86），腫瘤組織中ETV1的表達(dá)是正常組織的7.41倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.001）。

Western-blot法檢測顯示，ETV1蛋白在胃腸道間質(zhì)瘤中的表達(dá)水平（1.240.67）也較瘤旁正常組織高（0.880.28）（P=0.0369）；Pearson相關(guān)分析顯示，ETV1mRNA和蛋白水平呈正相關(guān)（r=0.526，P=0.017）。

結(jié)論：

ETV1在胃腸道間質(zhì)瘤中特異性高表達(dá)，可能與胃腸道間質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，有望成為新的腫瘤標(biāo)志物，為臨床治療提供新靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】胃腸道間質(zhì)瘤；轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子；腫瘤發(fā)生【Abstract】Objective：

ToinvestigatetheexpressionofETV1ingastrointestinalstromaltumorsanditsclinicalsignificance.Method：

Surgicalgastrointestinalstromaltumortissuesandadjacentnormalmucosawereobtainedfrom135patientswithgastrointestinalstromaltumor.ImmunohistochemistrywasconductedtodetectthedistributionofETV1protein，whilethequantitativereal-timereversetranscriptasepolymerasechainreactionandWesternblotmethodwereusedtodetecttheexpressionsofETV1mRNAandprotein.Result：

ImmunohistochemicalanalysisshowedthepositiverateofETV1expressionwas68.1%ingastrointestinalstromaltumortissues，itwassignificantlyhigherthan5.2%intheadjacentnormalsamples（P0.05）.Fluorescencequantitativepolymerasechainreaction（PCR）showedthatrelativeexpressionofCtvaluewas（3.302.37）ingastrointestinalstromaltumortissues，itwassignificantlylowerthan（6.192.86）inadjacentnormalsamples，expressionofETV1intumortissuewas7.41timesofnormaltissue，thedifferencewasstatisticallysignificant（P0.001）.WesternblotanalysisrevealedthattheexpressionofETV1proteinwas（1.240.67）ingastrointestinalstromaltumortissues，itwassignificantlyhigherthan（0.880.28）innormalcolorectaltissues（P=0.0369）.PearsoncorrelationanalysisshowedthatthemRNAlevelwasinpositivecorrelationwiththeproteinlevel（r=0.526，P=0.017）.Conclusion：

ThespecificexpressionoftheETV1isinacorrelationwiththepathogenesisofgastrointestinalstromaltumor.ETV1isexpectedtobeanewtumormarkerandthenewtargetforclinicaltherapy.【Keywords】Gastrointestinalstromaltumor；Transcriptionregulatoryfactors；TumorigenesisFirst-authorsaddress：

TheFirstAffiliatedHospitalofZhejiangUniversityMedicalCollege，Hangzhou310000，Chinadoi：

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.25.001ETS家族是最大的信號依賴轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族之一，其過度表達(dá)和許多人類腫瘤發(fā)生有關(guān)，近年來已成為各國學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)。

ETS變異體1（ETV1，ER81）是ETS家族成員之一。

已有研究表明，ETV1在乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、尤文氏瘤中過度表達(dá)，參與腫瘤的形成和發(fā)展[1-5]。

國外已有研究發(fā)現(xiàn)，ETV1在胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinalstromaltumor，GIST）細(xì)胞中存在普遍高表達(dá)[6]，但是國內(nèi)鮮有相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western-blot方法檢測GIST及瘤旁正常組織中ETV1的表達(dá)，探索其表達(dá)差異的意義。

1材料與方法1.1標(biāo)本來源選取本院2012年5月-2014年1月經(jīng)手術(shù)治療的GIST患者135例。

其中男68例，女67例，年齡24～83歲，平均（58.711.8）歲，中位年齡59歲。

腫瘤發(fā)生部位包括胃104例，小腸24例，其他部位7例。

所有手術(shù)病例均為初治，術(shù)前均未行放、化療或伊馬替尼等分子靶向治療。

GIST標(biāo)本取自病灶中央無壞死部分，另取距腫瘤邊緣大于3cm的瘤旁正常組織，離體后立即切成大約0.5cm小塊，于10min內(nèi)放于液氮中保存，后轉(zhuǎn)存于-80℃冰箱。

部分標(biāo)本用4%甲醛固定，石蠟包埋，做免疫組化染色。

所有標(biāo)本均經(jīng)過病理科醫(yī)師證實(shí)為GIST。

本實(shí)驗(yàn)獲得醫(yī)院倫理委員會同意。

1.2免疫組化染色組織石蠟包埋制成厚約4m組織切片，常規(guī)HE染色和免疫組化染色。

每批染色均用已知陽性切片做陽性對照，用PBS代替一抗做陰性對照。

結(jié)果判定：

以胞質(zhì)、胞核或胞膜染有均勻棕黃色顆粒、染色強(qiáng)度高于背景非特異性染色者為陽性細(xì)胞。

采用雙盲法，選取5個(gè)高倍視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

按半定量評分方法進(jìn)行計(jì)算：

根據(jù)每視野著色細(xì)胞占總細(xì)胞的數(shù)目（陽性細(xì)胞0、1%～25%、26%～50%、50%）分別記為0、1、2、3分；按每張切片著色細(xì)胞的染色強(qiáng)度（陰性、弱、中、強(qiáng)）分別記為0、1、2、3分；根據(jù)兩項(xiàng)評分之和判斷結(jié)果：

2分為陰性，3為陽性。

1.3RT-PCR檢測ETV1mRNA表達(dá)1.3.1總RNA提取稱取100mg組織，勻漿后用TRIzol法進(jìn)行GIST組織及瘤旁組織的總RNA提取。

紫外分光光度計(jì)定量并檢測其純度，A260/A280比值在1.8～2.0。

按照TakaraPrimeScript?RTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）試劑盒（Takara公司）說明書步驟將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCRETV1正向引物為5-GCAGTCAAGAACAGCCCTTTA-3，反向引物為5-TCAGGTTTCGGTGTATGAGTTG-3。

以GAPDH為內(nèi)參照，其正向引物為5-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3，反向引物為5-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3。

取cDNA1L，按照SYBR?PremixExTaq?（TliRNaseHPlus）試劑盒（Takara公司）說明書步驟進(jìn)行反應(yīng)，95℃預(yù)變性30s，隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)（95℃變性5s，60℃退火與延伸34s）。

腫瘤組織與正常組織的相對表達(dá)Ct值，即?Ct=Ct（ETV1）-Ct（GAPDH）。

腫瘤組織中ETV1表達(dá)相對于瘤旁正常組織的倍數(shù)用2-??Ct計(jì)算。

1.4Westernblot法檢測ETV1蛋白表達(dá)取100mg新鮮組織，將組織粉碎后加入裂解液提取總蛋白，4℃離心10min，提取上清液，BCA法測定蛋白含量。

在提取出的蛋白中加入適量5上樣緩沖液煮沸10min。

取等量樣本于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）。

5%脫脂牛奶室溫封閉2h，與兔抗人ETV1單克隆抗體或GAPDH單克隆抗體4℃孵育過夜，洗膜，與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體室溫孵育1h，洗膜。

用ECL顯色曝光。

組織中不同蛋白表達(dá)水平用目的條帶與內(nèi)參GAPDH條帶的灰度值比值定量表示。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（xs）表示，比較采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，采用字2檢驗(yàn)，Kruskal―Wallis等級相關(guān)采用Spearman方法，以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果2.1ETV1的免疫組化染色結(jié)果ETV1免疫組化陽性染色產(chǎn)物位于細(xì)胞核。

ETV1在GIST中普遍高表達(dá)，陽性率達(dá)68.1%（92/135），但是在瘤旁正常組織基本不表達(dá)，為5.2%（7/135），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），見圖1。

3討論GIST是消化系統(tǒng)最常見的間葉源性腫瘤，它主要是由c-kit或者PDGFRA基因致瘤突變導(dǎo)致，發(fā)病率約為1/10萬～2/10萬人，近年來呈明顯增加的趨勢。

伊馬替尼等分子靶向藥物的應(yīng)用，極大地提高了GIST的藥物療效。

但是，伊馬替尼的成功應(yīng)用并未根除間質(zhì)瘤，腫瘤復(fù)發(fā)和耐藥成為影響療效的關(guān)鍵因素[7-8]。

因此，探索GIST表面分子特性，尋找新的分子靶標(biāo)已成為目前GIST診治研究的熱點(diǎn)。

ETS家族是最大的信號依賴轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族之一，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)30多個(gè)ETS家族成員，它們均含有一個(gè)由85個(gè)氨基酸組成的特異DNA結(jié)合區(qū)（ETS區(qū)），該區(qū)與靶基因啟動區(qū)一個(gè)富含嘌呤的序列GGAA/T結(jié)合后調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。

ETV1是ETS家族成員之一，ETV1及其相關(guān)ETS轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控多能祖細(xì)胞分化，在組織發(fā)育過程中差異表達(dá)，過度表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞惡性改變[9-10]。

在一些腫瘤中ETV1基因參與某些染色體易位突變，基因融合產(chǎn)生嵌合體蛋白導(dǎo)致細(xì)胞惡性變，被認(rèn)為是促使腫瘤發(fā)生的主要因素之一，如前列癌中ETV1和跨膜絲氨酸蛋白酶2基因的融合、尤文氏肉瘤中ETV-1和EWS基因的融合[1，5]。

前列腺癌中過度表達(dá)的ETV1也可以和雄激素受體作用促成腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[11]。

其他腫瘤如黑色素瘤、乳腺癌中也存在ETV1蛋白過度表達(dá)，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖中起重要作用[2-4]。

進(jìn)一步研究表明，ETV1對靶基因的作用由復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)節(jié)。

各種信號激活Ras/Raf/MAPK信號通路是調(diào)控ETV1的主要途徑[2，12-13]。

Ras/Raf/MAPK通路的激活導(dǎo)致ETS轉(zhuǎn)錄因子活化，從而調(diào)控生長和周期相關(guān)基因，如c-myc、junB、cdc2和cyclinD139[14]。

在ETS的參與作用下，Ras信號成功轉(zhuǎn)化成一系列生長、凋亡相關(guān)基因。

在前列腺癌、黑色素瘤中，Ras-MAPK-ETV1通路進(jìn)一步得到了驗(yàn)證，Ras-MAPK的激活是調(diào)控ETV1的主要途徑[2，12-13]。

Chi等[6]研究發(fā)現(xiàn)，ETV1在伊馬替尼敏感或耐藥GIST細(xì)胞中普遍表達(dá)，且ETV1在GIST中的表達(dá)水平明顯高于其他腫瘤，如胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、黑色素瘤、卵巢癌等。

ETV1能夠與KIT協(xié)同作用，調(diào)控GIST細(xì)胞的增殖凋亡與惡性轉(zhuǎn)變。

本研究結(jié)果表明，ETV1在GIST組織中的基因和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)，在瘤旁正常組織很少表達(dá)，與Chi等[6]研究結(jié)果符合。

該結(jié)果提示ETV1在GIST中特異性表達(dá)，可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。

但是否將ETV1的表達(dá)作為評估腫瘤惡性程度及預(yù)測發(fā)展仍有待進(jìn)一步研究。

深入探索ETV1在GIST發(fā)生發(fā)展中的可能作用機(jī)制，將為GIST的診治提供新的思路。

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