PCR擴增技術(shù)培訓課件

DNA聚合酶引物引物M13噬菌體Sanger的測序技術(shù)引物DNA聚合酶1PCR擴增技術(shù)8/23/2024引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段2PCR擴增技術(shù)8/23/202494℃變性50-65℃退火XX℃延伸3PCR擴增技術(shù)8/23/2024Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)405060708090100100806040204PCR擴增技術(shù)8/23/202472℃94℃55℃PCR循環(huán)5PCR擴增技術(shù)8/23/2024一、PCR的基本原理

PCR技術(shù)實際上是DNA的體外擴增技術(shù)。其原理類似于DNA在體內(nèi)的復(fù)制過程。只要提供一個合適的條件――模板DNA、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、四種dNTP原料和合適的緩沖液體系，在一定的溫度下，經(jīng)過重復(fù)的過程，就可以完成DNA的體外合成。PCR反應(yīng)是一個重復(fù)進行的DNA復(fù)制過程，需要重復(fù)進行：模板的解鏈、引物與模板的結(jié)合（粘合）、DNA聚合酶催化新鏈DNA的合成。6PCR擴增技術(shù)8/23/2024這些過程都是通過控制溫度來實現(xiàn)的，即通過改變溫度引起變性（denature）、退火（annealing）和延伸（extension），使DNA得以復(fù)制。1、變性通過加熱至95℃左右，使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA，作為反應(yīng)的模板。2、退火將溫度降至引物的Tm值左右或以下（比Tm低5℃，通常為55～65℃），引物與DNA模板互補結(jié)合，形成雜交鏈。7PCR擴增技術(shù)8/23/20243、延伸在DNA聚合酶（一種耐熱的DNA聚合酶）的作用下，于70～74℃以引物3′端為起始點按5′→3′方向使DNA新鏈延伸。

上述三步為一個循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個循環(huán)的模板，如此經(jīng)過25－30個循環(huán)，可使新生的DNA片段得以擴增106－9倍（至少擴增105

倍）。PCR的反應(yīng)原理也就是PCR的基本過程。

8PCR擴增技術(shù)8/23/20241234522557294時間（min）溫度（℃）PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍9PCR擴增技術(shù)8/23/2024復(fù)性（退火）10PCR擴增技術(shù)8/23/2024延伸11PCR擴增技術(shù)8/23/2024變性12PCR擴增技術(shù)8/23/2024復(fù)性（退火）13PCR擴增技術(shù)8/23/2024延伸14PCR擴增技術(shù)8/23/2024變性15PCR擴增技術(shù)8/23/2024

復(fù)性（退火）16PCR擴增技術(shù)8/23/2024延伸17PCR擴增技術(shù)8/23/20241）PCR反應(yīng)成分（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會導致反應(yīng)的非特異性增加。PCR反應(yīng)條件18PCR擴增技術(shù)8/23/2024（2）引物濃度

0.1-0.5mol/L

濃度過高易導致模板與引物錯配,反應(yīng)特異性下降。（3）Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)0.5-2.5U/50l

酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。19PCR擴增技術(shù)8/23/2024（4）dNTPdNTP濃度取決于擴增片段的長度四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量

dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。20PCR擴增技術(shù)8/23/2024（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。21PCR擴增技術(shù)8/23/20242）循環(huán)參數(shù)變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈

95oC20-30秒(2)退火溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。22PCR擴增技術(shù)8/23/2024（3）延伸

70-75oC，延伸時間由擴增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù)主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過多：擴增效率降低