cDNA末端快速擴增技術RACE培訓課件

技術背景基本RACE原理和方法樣品要求RACE產物的鑒定和全長cDNA

的獲得基本RACE原理8/23/20241cDNA末端快速擴增技術RACE技術背景得到某基因的片段、全長或近全長cDNA的方法：建立和篩選cDNA和DNA文庫。利用GenBank數(shù)據庫中的表達序列標簽(expresssequencetags,ESTs)拼接出全長或近全長cDNA。是多聚酶鏈式反應即PCR。cDNA末端快速擴增(RACE)技術。用RNase保護、S1核酸酶譜和引物延伸等方法來保證mRMA5′末端的獲取，但又需要大量的mRNA。8/23/20242cDNA末端快速擴增技術RACE基本RACE原理和方法利用Oligo(dT)對mRNA進行反轉錄的同時在兩頭加上通用接頭(引物)，從而可利用基因特異的引物

(genespecificprimer，GSP)

通過PCR反應快速獲得目的序列的5′端和

3′端。8/23/20243cDNA末端快速擴增技術RACERACE流程8/23/20244cDNA末端快速擴增技術RACE5′-RACE法

原理圖

（1）（2）（3）（4）RNaseH8/23/20245cDNA末端快速擴增技術RACE樣品要求：

提取TotalRNA的材料要新鮮，采樣后立即放入液氮中速凍或加入樣品穩(wěn)定劑。

TotalRNA無降解，OD260/280=1.8~2.0。

提供盡量多的實驗材料：3′RACETotalRNA＞15μg；5′RACETotalRNA＞25μg。如果基因的含量較低或者未知序列較長，樣品量需相應增加。8/23/20246cDNA末端快速擴增技術RACERACE產物的鑒定和全長cDNA的獲得3′或5′雙鏈cDNA限制性內切酶酶切Southernblot分析克隆3′和5′重疊序列的連接RACE產物的3′和5′末端序列的分析合成相應引物PCR獲得全長cDNA8/23/20247cDNA末端快速擴增技術RACESMARTRACEcDNAsynthesisKit8/23/20248cDNA末端快速擴增技術RACESMARTRACEcDNAsynthesisKit堿基互補配對原則AT之間形成兩個氫鍵GC之間形成三個氫鍵poly(C)替代poly(A)增加5′接頭與cDNA第一鏈的結合牢固性增加模板中有效雙鏈豐度提高目的基因獲取幾率8/23/20249cDNA末端快速擴增技術RACESMARTRACEcDNAsynthesisKit原理8/23/202410cDNA末端快速擴增技術RACEcDNA第一鏈的合成機制8/23/202411cDNA末端快速擴增技術RACESMARTerRACE流程

8/23/202412cDNA末端快速擴增技術RACE5’RACE流程圖8/23/202413cDNA末端快速擴增技術RACE3’RACE流程圖8/23/202414cDNA末端快速擴增技術RACEGSP與cDNA模板的關系GSP要求：23–28nt50–70%GCTm≥65℃；降落式（touchdown）PCR，Tm>70℃與通用引物的3’-末端不互補8/23/202415cDNA末端快速擴增技術RACEGSP與cDNA模板的關系GSP1：5’-RACEPCR的反義引物GSP2：3’-RACEPCR的正義引物合適的酶切位點100~200bp注意：GSP1與GSP2的Tm值要相似8/23/202416cDNA末端快速擴增技術RACEGSP與cDNA模板的關系NGSP：槽式（Nested）PCR引物8/23/202417cDNA末端快速擴增技術RACE擴增后的預期：8/23/202418cDNA末端快速擴增技術RACE具體實驗方法cDNA第一鏈的合成陽性對照RACEPCR實驗cDNA末端的快速擴增RACE產物鑒定試劑盒試劑8/23/202419cDNA末端快速擴增技術RACE比較用GSPs和NGSPs