JJF(皖) 165-2023 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀校準(zhǔn)規(guī)范

(皖)安徽省地方計(jì)量技術(shù)規(guī)范JJF（皖）165—2023實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀校準(zhǔn)規(guī)范CalibrationSpecificationforReal-TimeFluorescentQuantitativePolymeraseChainReactionAnalyzer2023-08-03發(fā)布 2023-10-01實(shí)施安徽省市場(chǎng)監(jiān)督管理局 發(fā)布JJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023JJF(皖)165-2023實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀校準(zhǔn)規(guī)范JJF(皖)165-2023CalibrationSpecificationforReal-TimeFluorescentQuantitativePolymeraseChainReactionAnalyzer歸 口單位安省醫(yī)計(jì)量術(shù)委會(huì)主起單安省計(jì)科學(xué)究院安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院本規(guī)范主要起草人：徐俊）王成）（）（））參加起草人：賀輝（徽省量科研究）呂 吉安徽計(jì)量學(xué)研院）李 征北京電偉電子術(shù)有公司）JJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023II目 錄引言 （III）1 范圍 （1）引用文件 （1）術(shù)語(yǔ)和計(jì)量單位 （1）聚合酶鏈反應(yīng) （1）聚合酶鏈反應(yīng)分析儀 （1）實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)分析儀 （1）溫度示值誤差 （1）溫度均勻度 （1）溫度波動(dòng)度 （2）溫度最大過(guò)沖量 （2）平均升溫速率 （2）平均降溫速率 （2）熒光染料 （2）熒光強(qiáng)度精密度 （2）閾值循環(huán)數(shù) （2）閾值循環(huán)數(shù)精密度 （2）溶解溫度 （2）溶解曲線 （2）熔解溫度漂移 （2）峰值強(qiáng)度 （3）通道峰值強(qiáng)度一致性 （3）線性靈敏系數(shù) （3）熔解溫度比 （3）樣本示值誤差 （3）樣本線性 （3）4 概述 （3）計(jì)量特性 （4）校準(zhǔn)條件 （5）測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)及其他設(shè)備 （5）校準(zhǔn)項(xiàng)目和校準(zhǔn)方法 （6）校準(zhǔn)項(xiàng)目 （6）校準(zhǔn)方法 （6）校準(zhǔn)結(jié)果表達(dá) （12）復(fù)校時(shí)間間隔 （13）附錄A 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的準(zhǔn)備及配制 （14）附錄B PCR反應(yīng)體系的配制 （16）附錄C 測(cè)量不確定度評(píng)定示例 （17）附錄D 校準(zhǔn)原始記錄格式 （23）附錄E 校準(zhǔn)證書(shū)內(nèi)頁(yè)格式 （28）IIJJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023IIIIII1111引 言JJF1071-2010《國(guó)家計(jì)量校準(zhǔn)規(guī)范編寫(xiě)規(guī)則》、JJF1001-2011《通用計(jì)量術(shù)語(yǔ)及定義》、JJF1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》共同構(gòu)成了支撐本規(guī)范編制工作基礎(chǔ)性系列文件。校準(zhǔn)方法及計(jì)量特性等主要參考了JJF1527-2015《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》、YY/T1173-2010聚合酶鏈反應(yīng)分析儀、JJF1101-2019《環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備溫度、濕度參數(shù)校準(zhǔn)規(guī)范》。本規(guī)范為首次發(fā)布。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀校準(zhǔn)規(guī)范范圍本規(guī)范適用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的校準(zhǔn)，其他類型PCR儀相同原理部分可參照本規(guī)范執(zhí)行。引用文件本規(guī)范引用了下列文件：JJF1527聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范YY/T1173聚合酶鏈反應(yīng)分析儀JJF1101環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備溫度、濕度參數(shù)校準(zhǔn)規(guī)范凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本規(guī)范；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本規(guī)范。術(shù)語(yǔ)和計(jì)量單位PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）polymerasechainreactionPCR即聚合酶鏈反應(yīng)是一種對(duì)特定的DNA或RNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法，由變性—退火—延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。（YY/T1173-2010）PCR儀（聚合酶鏈反應(yīng)分析儀）polymerasechainreactionanalyzer,PCRanalyzer基于PCR技術(shù)原理，模擬DNA或者RNA的復(fù)制過(guò)程，在模板、引物、聚合酶等存在的條件下，特異擴(kuò)增已知序列，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)分析的儀器設(shè)備。（YY/T1173-2010）實(shí)時(shí)熒光PCRreal-timepolymerasechainreactionPCR在PCR過(guò)程中利用熒光染料釋放的熒光能量的變化直接反映出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，熒光信號(hào)變量與擴(kuò)增產(chǎn)物變量成正比，并通過(guò)對(duì)熒光的采集和分析以達(dá)到對(duì)原始模板量進(jìn)行分析的PCR。（YY/T1173-2010）注：在每個(gè)循環(huán)中監(jiān)測(cè)擴(kuò)展產(chǎn)物是否可被檢測(cè)。temperatureindicationerror熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)分析儀均熱塊設(shè)定溫度值與實(shí)際溫度平均值之差。單位：攝氏度，符號(hào)：℃。temperatureuniformity均熱塊內(nèi)所有采樣測(cè)量孔溫度孔溫度平均值的最大值與最小值之差。單位：攝氏度，符號(hào)：℃。JJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023PAGEPAGE10PAGEPAGE3temperaturevolatility在被檢設(shè)備穩(wěn)定的狀態(tài)下，在規(guī)定的時(shí)間間隔內(nèi)，均熱塊所有采樣點(diǎn)中任意一點(diǎn)溫度隨時(shí)間的變化量。冠以“±”號(hào)。單位：攝氏度，符號(hào)：℃。temperaturemaximumovershoot均熱塊溫度升高或降低至設(shè)定值過(guò)程中，所有采樣測(cè)量孔溫度超出（高于或低于）設(shè)定值的最大幅度。單位：攝氏度，符號(hào)：℃。meanheatingrate升溫過(guò)程中模塊單位時(shí)間內(nèi)上升的平均溫度度數(shù)。單位：攝氏度每秒，符號(hào)：℃/s。（YY/T1173-2010）meancoolingrate降溫過(guò)程中模塊單位時(shí)間內(nèi)下降的平均溫度度數(shù)。單位：攝氏度每秒，符號(hào)：℃/s。（YY/T1173-2010）fluorochrome由短波長(zhǎng)激發(fā)光激發(fā)，釋放出可見(jiàn)光的試劑。（YY/T1173-2010）precisionoffluorescenceintensity對(duì)多個(gè)檢測(cè)孔在同一熒光條件下重復(fù)熒光強(qiáng)度檢測(cè)，其檢測(cè)值的一致性。（YY/T1173-2010）閾值循環(huán)數(shù)Ct(Cp)cyclethreshold,crossingpoint實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中，反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)指數(shù)擴(kuò)增時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)周期數(shù)。主要的計(jì)算方式是以擴(kuò)增過(guò)程前3~15個(gè)循環(huán)的熒光值的10超過(guò)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)則為閾值循環(huán)數(shù)(Ct)。（YY/T1173-2010）precisionofcyclethreshold均熱塊不同測(cè)量孔在同一熒光條件下閾值循環(huán)數(shù)重復(fù)測(cè)量的一致性。melttemperature（Tm）總的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時(shí)的溫度稱為熔解溫度，簡(jiǎn)稱Tm值，不同序列的DNA，Tm值不同。單位：攝氏度，符號(hào)：℃。meltcurvePCR過(guò)程中均熱塊測(cè)量孔的熒光強(qiáng)度(縱坐標(biāo))與溫度(橫坐標(biāo))形成的曲線。melttemperature（Tm）bias根據(jù)熔解曲線計(jì)算的熔解溫度值與光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器熔解溫度設(shè)定值之差。單位：攝氏度，符號(hào)：℃。peakintensity熔解曲線上熔解溫度對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度。 channelpeakintensityconsistency（CPHC）熔解曲線上，所有采樣測(cè)量孔峰值強(qiáng)度的變化趨勢(shì)。峰高的差異表明熒光定量PCR儀的光路、光學(xué)、光學(xué)檢測(cè)和靈敏度的差異，理想的熒光定量PCR儀，CPHC為1.00。linearsensitivityfactor（LSF）同一熔解溫度下，表征熔解曲線線性變化靈敏程度的比率。理想的熒光定量PCR儀，線性靈敏度應(yīng)該是1.00。LSF在0.80和1.20之間，溶解曲線呈現(xiàn)基本線性；LSF<0.80：在高熒光強(qiáng)度下線性降低，注意信號(hào)飽和；LSF>1.20：在低熒光強(qiáng)度下線性降低，注意最小信號(hào)檢測(cè)和靈敏度。ratioofmelttemperature（RTm）同一熔解溫度下，表征熔解溫度漂移因素的比率。RTm在0.80到1.20之間：相同產(chǎn)品熔解溫度不同，差異僅基于控溫模塊特性，熔解峰漂移與溫度不均勻直接相關(guān)；RTm>1.20：相同產(chǎn)品熔解溫度不同，差異是由控溫模塊、光學(xué)和光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)不準(zhǔn)確共同導(dǎo)致的；RTm<0.80：相同產(chǎn)品熔解溫度不同，差異是與光學(xué)、光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)及分析軟件直接相關(guān)。errorofsample’sindication被測(cè)儀器測(cè)量平均值與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)稱值之差。單位：拷貝數(shù)/微升，符號(hào)：copyies/μL。樣本線性Samplesofthelinear系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)擴(kuò)增Ct值對(duì)濃度對(duì)數(shù)值的線性回歸系數(shù)。概述實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，全稱為實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)分析儀（real-timefluorescentquantitativePCRanalyzer,RFQ-PCR，以下簡(jiǎn)稱實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀）是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，同時(shí)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)擴(kuò)增基因進(jìn)行定量分析的儀器。標(biāo)記有熒光染料的探針與模板基因混合后，完成高溫變性、低溫復(fù)性和適溫延伸的熱循環(huán)后，與模板基因互補(bǔ)配對(duì)的探針被切變化的熒光信號(hào)強(qiáng)度，既可對(duì)待測(cè)擴(kuò)增基因進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀均熱塊一般有32孔板、48孔板、96孔板和384孔板等幾種類型，其中96孔板應(yīng)用最為廣泛。如圖1所示，其主要由溫度控制模塊、微量熒光檢測(cè)模塊、均熱塊、電腦控制系統(tǒng)、計(jì)算機(jī)及應(yīng)用軟件組成。圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀結(jié)構(gòu)示意圖

一般情況下，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀計(jì)量性能指標(biāo)如表1所示。表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀計(jì)量性能指標(biāo)序號(hào)項(xiàng)目技術(shù)指標(biāo)備注1溫度示值誤差30℃50℃60℃70℃90℃95℃±0.5℃溫度項(xiàng)目2溫度均勻度≤1.0℃3溫度波動(dòng)度≤0.2℃4溫度最大過(guò)沖量≤3.0℃5平均升溫速率50℃→90℃≥1.5℃/s6平均降溫速率90℃→50℃≥1.5℃/s7閾值循環(huán)數(shù)示值誤差±2.5光學(xué)系統(tǒng)物理項(xiàng)目8閾值循環(huán)數(shù)均勻度≤59閾值循環(huán)數(shù)精密度≤10%10通道峰值強(qiáng)度一致性±0.211線性靈敏系數(shù)±0.212熔解溫度漂移±1℃13熔解溫度比±0.214樣本示值誤差±15%光學(xué)系統(tǒng)生物化學(xué)項(xiàng)目15樣本線性相關(guān)系數(shù)≥0.980校準(zhǔn)條件儀器使用允許的環(huán)境條件，測(cè)量過(guò)程中應(yīng)測(cè)量和記錄環(huán)境的溫度、相對(duì)濕度。測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器集成了溫度傳感器和發(fā)射光發(fā)生器兩部分，該兩部分可以為集成裝置。其溫度測(cè)量范圍為（0～120）℃，最大允許誤差為±0.1范圍為（360～780）nm，相對(duì)光輻射強(qiáng)度在（10%～100%）范圍內(nèi)可調(diào)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校準(zhǔn)時(shí)應(yīng)采用國(guó)內(nèi)外有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，包括：質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、核糖核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其特性量值（拷貝數(shù)≥109copies/μL，相對(duì)擴(kuò)展不確定度≤5%）。電子天平精度≤0.01mg，且需要計(jì)量檢定合格。移液器規(guī)格：2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL，且需要計(jì)量檢定合格。校準(zhǔn)前按照附錄A配置校準(zhǔn)時(shí)使用的溶液。校準(zhǔn)項(xiàng)目和校準(zhǔn)方法校準(zhǔn)項(xiàng)目校準(zhǔn)項(xiàng)目主要分為溫度項(xiàng)目和光學(xué)系統(tǒng)項(xiàng)目?jī)纱箢?，具體項(xiàng)目見(jiàn)表1?？筛鶕?jù)客戶要求與實(shí)際情況選擇光學(xué)系統(tǒng)物理校準(zhǔn)方法或光學(xué)系統(tǒng)生物化學(xué)校準(zhǔn)方法中的一種方法對(duì)熒光定量PCR儀光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)。校準(zhǔn)方法校準(zhǔn)前的準(zhǔn)備工作PCR儀均熱塊孔數(shù)少于96孔時(shí)，測(cè)量點(diǎn)為12個(gè)，布點(diǎn)圖（以48孔為例）如圖2所示。PCR儀均熱塊孔數(shù)大于或等于96點(diǎn)時(shí)，測(cè)量點(diǎn)為15個(gè)，布點(diǎn)圖如圖3根據(jù)被測(cè)PCR儀說(shuō)明書(shū)或客戶要求，增加或減少測(cè)量點(diǎn)數(shù)量，并圖示說(shuō)明。校準(zhǔn)前將PCR儀預(yù)熱30min。將儀器及光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器各部件連接完好，在光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器下部的溫度傳感器表面上涂抹適量導(dǎo)熱油，以確保其與均熱塊測(cè)量孔接觸良好。將光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器分布于均熱塊測(cè)量孔中。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的準(zhǔn)備與配置按照附錄A執(zhí)行。PCR反應(yīng)體系的配置按照附錄B執(zhí)行。圖2 12個(gè)光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器位置分布示意圖 圖3 15個(gè)光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器位置分布示意圖校準(zhǔn)過(guò)程溫度項(xiàng)目校準(zhǔn)時(shí)，典型的校準(zhǔn)設(shè)置程序如表2步驟4～11所示（其中平均升、降溫速率的測(cè)量數(shù)據(jù)分別來(lái)源于步驟4到步驟5和步驟5到步驟6；溫度示值誤差的測(cè)量數(shù)據(jù)來(lái)源于步驟5～11；溫度均勻度、溫度波動(dòng)度、溫度最大過(guò)沖量的測(cè)量數(shù)據(jù)來(lái)源于步驟5～10。光學(xué)系統(tǒng)采用物理校準(zhǔn)方法時(shí)，典型的校準(zhǔn)設(shè)置程序如表2步驟12～16所示（步驟12和步驟13之間設(shè)定程序循環(huán)32次）型的校準(zhǔn)設(shè)置程序如表3所示。也可以根據(jù)被測(cè)PCR儀說(shuō)明書(shū)或客戶要求，參照表2或表3進(jìn)行設(shè)定，并說(shuō)明具體參數(shù)校準(zhǔn)時(shí)所選取的溫度值。表2 溫度校準(zhǔn)控制程序步驟設(shè)定溫度點(diǎn)持續(xù)時(shí)間備注130℃60s預(yù)熱295℃60s330℃60s430℃60s溫度控制595℃180s630℃120s790℃180s850℃180s970℃180s1060℃180s1130℃60s1285℃10s模擬光學(xué)擴(kuò)增過(guò)程重復(fù)32個(gè)循環(huán)1360℃30s1495℃15s擴(kuò)增變性1560℃30s熔解曲線分解1685℃10s表3 光學(xué)系統(tǒng)采用生物化學(xué)校準(zhǔn)方法的校準(zhǔn)設(shè)置程序步驟設(shè)定溫度點(diǎn)持續(xù)時(shí)間循環(huán)數(shù)150℃120s1295℃600s1395℃30s45460℃60s溫度項(xiàng)目校準(zhǔn)溫度示值誤差溫度達(dá)到設(shè)定溫度30s后開(kāi)始記錄測(cè)量值，記錄5s，最少均勻記錄5組數(shù)據(jù)。溫度示值誤差的計(jì)算按照公式（1）計(jì)算：1n式中：T——溫度示值誤差，℃；Ts——設(shè)定溫度值，℃；

Ts ini1n

（1）Ti——第i個(gè)溫度傳感器測(cè)量值平均值，℃；n——溫度傳感器數(shù)量。溫度均勻度溫度達(dá)到設(shè)定溫度30s后開(kāi)始記錄測(cè)量值，記錄5s，最少均勻記錄5組數(shù)據(jù)。溫度均勻度的計(jì)算按照公式（2）計(jì)算：?=???ˉ?? （）式中：???——溫度均勻度，℃；ˉ??——所有測(cè)溫傳感器測(cè)定值平均值的最大值，；ˉ??——所有測(cè)溫傳感器測(cè)定值平均值的最小值，。溫度波動(dòng)度溫度達(dá)到設(shè)定溫度30s后開(kāi)始記錄各點(diǎn)量值，記錄60s，最少均勻記錄10組數(shù)據(jù)。溫度波動(dòng)度為實(shí)測(cè)最高溫度與最低溫度之差的一半，冠以“±”號(hào)。按照公式（3）計(jì)算：Tf

max[(TjmaxTjmin)/2]

（3）式中：Tf——溫度波動(dòng)度，℃；Tjmax——測(cè)量點(diǎn)j溫度傳感器在m次測(cè)量中的最高溫度，℃；Tjmin——測(cè)量點(diǎn)j溫度傳感器在m次測(cè)量中的最低溫度，℃。溫度最大過(guò)沖量溫度過(guò)沖量的計(jì)算按照公式（4）計(jì)算：式中：

??t

?tmax?

（4）??t——溫度最大過(guò)沖量，℃；?tmax——值，℃；TS——設(shè)定溫度值，℃。平均升溫速率被測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR定量?jī)x從（50±0.5）℃升溫至（90±0.5）℃時(shí)，平均升溫速率計(jì)算按照公式（5）計(jì)算：式中：

Tah

nn

TbiTaithin

（5）Tah——平均升溫速率，℃/s；——（50±0.5）℃i——（90±0.5）℃ithi——從到達(dá)的時(shí)間，s；n——溫度測(cè)量點(diǎn)的個(gè)數(shù)。平均降溫速率被測(cè)實(shí)時(shí)熒光儀定量PCR儀從（90±0.5）℃降溫至（50±0.5）℃時(shí)，平均降溫速的計(jì)算按照公式（6）計(jì)算：nTTnT

bi i1 tci

（6）式中：

ac nTac——平均降溫速率，℃/s；tci——從Tbi到達(dá)Tai的時(shí)間，s。光學(xué)系統(tǒng)物理校準(zhǔn)法閾值循環(huán)數(shù)示值誤差、均勻度和精密度閾值循環(huán)數(shù)Ct示值誤差的計(jì)算按照公式（7）計(jì)算，均勻度的計(jì)算按照公式（8）計(jì)算，精密度按照公式（9）計(jì)算Ct值的相對(duì)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以其作為Ct值精密度的表征。??=?q???ts （）1tq????1?1tq????1??1tq??式中：

??t

=?1 ×Σ1?t??

×100% （9）?t?——第i個(gè)采樣測(cè)量點(diǎn)閾值循環(huán)數(shù)C示值誤差；tq?——iR?ts——熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器實(shí)際經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)；??tu——閾值循環(huán)數(shù)均勻度；??tqmax——所有采樣孔熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)的閾值循環(huán)數(shù)最大值；??tqmin——所有采樣孔熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)的閾值循環(huán)數(shù)最小值；????t——閾值循環(huán)數(shù)精密度；n——光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器數(shù)量。通道峰值強(qiáng)度一致性、線性靈敏系數(shù)當(dāng)DNA循環(huán)擴(kuò)增從最大熒光強(qiáng)度（100%）減弱到20%時(shí)，儀器理論上所接受到的熒光強(qiáng)度也線性遞減。計(jì)算熔解曲線上熔解溫度（Tm）附近的溫度點(diǎn)對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度，得到通道峰值強(qiáng)度一致性（CPHC）和線性靈敏系數(shù)（LSF），分別由公式（10）、公式（11）計(jì)算：CPHCi

BC

（10）iLSFi

AiBiBiCi

（11）式中：CPHCi——通道峰值強(qiáng)度一致性Bi——Tm-2℃時(shí)，第i個(gè)采樣孔對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度；Ci——Tm+2℃時(shí)，第i個(gè)采樣孔對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度；B——Tm-2℃時(shí)，所有采樣孔對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度平均值；C——Tm+2℃時(shí)，所有采樣孔對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度平均值；Ai——第i個(gè)采樣孔測(cè)量熔解曲線上溫度Tm對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度。LSFi——線性靈敏系數(shù)；熔解溫度漂移和熔解溫度比熔解溫度漂移的計(jì)算按照公式（12）計(jì)算，熔解溫度比的計(jì)算按照公式（13）計(jì)算。mm T T mm i i s

(12)式中：

RTmmax-mn

(13)mT ——第i個(gè)采樣測(cè)量孔熔解溫度漂移，℃；miiTm——實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀實(shí)測(cè)Tm值，℃；isTm——光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器TmRTm——熔解溫度比；s

值，℃；m T ——所有采樣測(cè)量孔實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的T最大值，℃；m maxm T ——所有采樣測(cè)量孔實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的T最小值，℃；m min

——光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器設(shè)定Tm時(shí)所有測(cè)溫傳感器測(cè)定值的最大值，℃；——光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器設(shè)定Tm時(shí)所有測(cè)溫傳感器測(cè)定值的最小值，℃。光學(xué)系統(tǒng)化學(xué)校準(zhǔn)法標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配置標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制方法見(jiàn)附錄A。校準(zhǔn)板的制備用經(jīng)過(guò)計(jì)量校準(zhǔn)的移液器，將配制好的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀反應(yīng)體系加入到反應(yīng)板中，按圖4所示準(zhǔn)備96孔校準(zhǔn)板，其他型號(hào)的儀器可參照本示例準(zhǔn)備，被校實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀反應(yīng)體系的配制方法見(jiàn)附錄B，溫度控制程序參照表3。圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣本示值誤差、樣本線性校準(zhǔn)用96孔反應(yīng)板樣本示值誤差按公式（16）計(jì)算，樣本線性按公式（17）計(jì)算。c=c?s （1）?1Ct???1Ct??t?=1Ct??t2? n???ˉ=1式中：?c——樣本示值誤差，copies/μL；c——儀器測(cè)量平均值，opis/μ；cs——標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)稱值，copies/μL；r——線性相關(guān)系數(shù)；C?——iCt值；t——Ct平均值；lnci——系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的第i個(gè)濃度的對(duì)數(shù)值；lnc——系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度對(duì)數(shù)值的平均值。校準(zhǔn)結(jié)果表達(dá)校準(zhǔn)結(jié)果應(yīng)在校準(zhǔn)證書(shū)（報(bào)告）上反應(yīng)，校準(zhǔn)證書(shū)（報(bào)告）應(yīng)至少包括以下信息：標(biāo)題，如“校準(zhǔn)證書(shū)”；實(shí)驗(yàn)室名稱和地址；進(jìn)行校準(zhǔn)的地點(diǎn)（如果與實(shí)驗(yàn)室的地址不同）；證書(shū)或報(bào)告的唯一性標(biāo)識(shí)（如編號(hào)），每頁(yè)及總頁(yè)數(shù)的標(biāo)識(shí)；客戶的名稱和地址；被校對(duì)象的描述和明確標(biāo)識(shí)；日期；如果與校準(zhǔn)結(jié)果的有效性和應(yīng)用有關(guān)時(shí)，應(yīng)對(duì)被校樣品的抽樣程序進(jìn)行說(shuō)明；對(duì)校準(zhǔn)所依據(jù)的技術(shù)規(guī)范的標(biāo)識(shí)，包括名稱及代號(hào)；本次校準(zhǔn)所用測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)的溯源性及有效性說(shuō)明；校準(zhǔn)環(huán)境的描述；校準(zhǔn)結(jié)果及其測(cè)量不確定度的說(shuō)明；對(duì)校準(zhǔn)規(guī)范的偏離的說(shuō)明；校準(zhǔn)證書(shū)和校準(zhǔn)報(bào)告簽發(fā)人的簽名、職務(wù)或等效標(biāo)識(shí)；校準(zhǔn)結(jié)果僅對(duì)被校對(duì)象有效的聲明；未經(jīng)實(shí)驗(yàn)室書(shū)面批準(zhǔn)，不得部分復(fù)制證書(shū)或報(bào)告的聲明。校準(zhǔn)原始記錄格式見(jiàn)附錄D，校準(zhǔn)證書(shū)（報(bào)告）內(nèi)頁(yè)格式見(jiàn)附錄E。復(fù)校時(shí)間間隔根據(jù)實(shí)際使用情況，用戶可自行確定儀器復(fù)校時(shí)間間隔，建議不超過(guò)12個(gè)月。附錄A試劑

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的準(zhǔn)備及配制質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或核糖核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)其特性量值（拷貝數(shù)≥109copies/μL，相對(duì)擴(kuò)展不確定度≤5%）滿足校準(zhǔn)需求，水為符合GB/T6682-2008規(guī)定的一級(jí)水。儀器電子天平，精度≤0.01mg；移液器，規(guī)格100μL、1000μL，且需要通過(guò)計(jì)量檢定。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)系列稀釋配制將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)從-20℃冰箱中取出，置冰上熔解，然后室溫平衡30min。用經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌處理的純水進(jìn)行稀釋配制，并定為陰性對(duì)照樣本。用電子天平配制系列稀釋樣品，其中S0為濃度為1×109copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7為S0系列稀釋后的樣品，每步樣品配制后要充分震蕩混勻，詳細(xì)配制方法見(jiàn)表A.1。表A.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)系統(tǒng)稀釋配制 mg項(xiàng)目S0S1S2S3S4S5S6S7H2O終濃度（copies/μL）S11009001×108S21009001×107S31009001×106S41009001×105S51009001×104S61009001×103S71009001×102未知樣品的配制以配制好的S3為起點(diǎn)，用經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)的天平（0.01mg）配制未知樣品1(U1)和未知樣品2(U2)，樣品配制后要充分震蕩混勻，詳細(xì)配制方法見(jiàn)表A.2。表A.2 標(biāo)未知樣品的配制 mg項(xiàng)目S3U1H2O終濃度（copies/μL）U15005005.0×105U23503502.5×105附錄B試劑

PCR反應(yīng)體系的配制ddH2O、10×PCRbuffer、25mmol/LMgCl2、dNTPs、10μmol/LProbe、10μmol/LPrimer1、10μmol/LPrimer2、5U/μLTaqenzyme、DNA。儀器移液器，規(guī)格2μL、10μL、100μL、2000μL、1000μL，且需要通過(guò)計(jì)量檢定。PCR反應(yīng)體系的配制參照表B.1進(jìn)行PCR反應(yīng)體系溶液的配制。表B.1 PCR反應(yīng)體系的配制試劑終濃度體積ddH2O/20.6μL10×PCRbuffer1×5μL25mmol/LMgCl22.5mmol/L5μLdNTPs0.2mmol/L4μL10μmol/LProbe0.2μmol/L1μL10μmol/LPrimer10.4μmol/L2.0μL10μmol/LPrimer20.4μmol/L2.0μL5U/μLTaqenzyme0.04U/μL0.4μLDNA/10.0μLtotal/50μL注：如果Mg2+、dNTPs和Taqenzyme已經(jīng)在10×PCRbuffer中，不需要加，如果使用2×PCRbuffer，調(diào)整加樣體積使?jié)舛群线m。ddH2O為滅菌雙蒸餾水，Probe為熒光標(biāo)記探針，Primer為引物，Taqenzyme為熱啟動(dòng)酶，buffer為緩沖溶液，dNTPs為四種脫氧核糖核苷-磷酸混合物。附錄C溫度示值誤差和閾值循環(huán)數(shù)示值誤差測(cè)量結(jié)果的不確定度評(píng)定示例溫度測(cè)量結(jié)果不確定度評(píng)定測(cè)量方法將實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCRPCR標(biāo)準(zhǔn)器的溫度傳感器表面上涂抹適量導(dǎo)熱油，將15個(gè)溫度傳感器置于儀器加熱模塊中，并確保與加熱模塊接觸良好。按照儀器說(shuō)明書(shū)或用戶要求或推薦使用的溫度控制程PCR擴(kuò)增光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器進(jìn)行溫度數(shù)據(jù)采集。溫度示值誤差的計(jì)算按照公式（C.1）進(jìn)行計(jì)算。測(cè)量模型115式中：

Ts i15i115

（C.1）T——采樣測(cè)量孔內(nèi)溫度示值誤差，℃；Ts——儀器設(shè)定溫度值，℃；Ti——第i個(gè)溫度傳感器測(cè)定值，℃。不確定度來(lái)源根據(jù)上述數(shù)學(xué)模型以及測(cè)量方法，其不確定度來(lái)源主要包括以下三個(gè)方面：測(cè)量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量；1溫度傳感器分辨力引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u；1溫度傳感器準(zhǔn)確度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u2；測(cè)量不確定度評(píng)定重復(fù)性測(cè)量引入的不確定度分量以95℃為例，對(duì)同一臺(tái)儀器，在相同的測(cè)量條件下，重復(fù)測(cè)量10次，溫度穩(wěn)定后讀取溫度測(cè)量值，15個(gè)溫度傳感器的重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)見(jiàn)表C.1。表C.1 溫度測(cè)量結(jié)果次數(shù)測(cè)量點(diǎn)不同測(cè)量點(diǎn)溫度傳感器測(cè)量結(jié)果（℃）12345678910A195.0194.9895.0194.9594.9894.9895.0195.0495.0194.98A495.2295.2295.2595.2595.2895.2295.1995.2295.1995.22A794.9394.9394.9394.9694.9394.9694.9394.9994.9194.96A1095.2695.2695.2695.2695.2695.2995.2695.2995.2695.26A1295.4995.4095.4095.4995.4695.5295.4695.4695.5295.46D195.0395.1595.0995.0995.0395.1295.0695.0995.0995.06D794.9094.8794.8794.8294.9394.9094.8794.8494.8794.87D1295.3795.2695.2995.2995.3295.2095.2995.2995.3595.29E494.9494.8594.8594.8594.8594.9494.8894.8594.9794.91E1095.3795.2895.3495.2895.3495.3795.3195.2895.3495.31H195.4795.4795.5095.4795.5095.5095.4795.4795.4795.50H495.0395.1295.0695.0695.0395.0995.0695.0695.0995.06H795.0395.0095.0395.0095.0095.0095.0095.0695.0095.00H1095.2595.2895.2595.3195.3195.2595.2895.2595.2595.28H1295.0194.9895.0194.9894.9594.9895.0194.9595.0395.01合并樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差按公式（C.2）計(jì)算：m n 2(ykj2S jk

yj)

（C.2）p m(n1)式中：m——測(cè)量點(diǎn)的數(shù)量；n——每個(gè)測(cè)量點(diǎn)測(cè)量次數(shù)；ykj——jk次的測(cè)量值，℃；yj——j個(gè)測(cè)量點(diǎn)測(cè)量值的平均值，℃；通過(guò)（C.2）Sp=0.0313℃由于每個(gè)點(diǎn)測(cè)量5次取平均值，因此重復(fù)測(cè)量引入的不確定度分量u1為：51uSp51

0.0134℃1溫度傳感器分辨力引入的不確定度u'1溫度傳感器的分辨力為0.01℃，分散區(qū)間半寬為0.005℃，按均勻分布計(jì)算，k=31，則u'為：31

31u'0.005℃31由于重復(fù)測(cè)量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u1大于分辨力引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量11u'，兩者具有一定的相關(guān)性，因此在不確定度計(jì)算時(shí)不考慮由讀數(shù)分辨力引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u'。11溫度傳感器準(zhǔn)確度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u2；溫度傳感器的最大允許誤差±0.1℃，按均勻分布計(jì)算，則：合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

u0.1℃0.058℃2 3u u2u2=0.06℃c 1 2擴(kuò)展不確定度取k2，則：Ukuc=0.12℃閾值循環(huán)數(shù)測(cè)量結(jié)果的不確定度評(píng)定測(cè)量方法將實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀及光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器各部件連接完好，將光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器的置于儀器加熱模塊中，并確保與加熱模塊接觸良好。按照儀器說(shuō)明書(shū)或用戶要求或推薦設(shè)置光學(xué)擴(kuò)增程序，并運(yùn)行該程序，同時(shí)啟動(dòng)PCR擴(kuò)增光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器進(jìn)行溫度和光學(xué)數(shù)據(jù)采集。示值誤差的計(jì)算按照公式（C.3）計(jì)算。測(cè)量模型式中：

?t?=?t??ts （C.）?t?——閾值循環(huán)數(shù)示值誤差；tq?——i?ts——光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器第i個(gè)采樣孔的閾值循環(huán)數(shù)；不確定度來(lái)源根據(jù)上述數(shù)學(xué)模型以及測(cè)量方法，其不確定度來(lái)源主要包括以下三個(gè)方面：測(cè)量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量；1光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器分辨力引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u；1標(biāo)準(zhǔn)器具引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2；測(cè)量不確定度評(píng)定重復(fù)性測(cè)量引入的不確定度分量對(duì)同一臺(tái)設(shè)備，在相同的測(cè)量條件下，使用光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器按照推薦的光學(xué)擴(kuò)增程序?qū)ζ溟撝笛h(huán)數(shù)進(jìn)行10次重復(fù)測(cè)量，對(duì)重復(fù)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行分析，測(cè)量結(jié)果表C.2所示：表C.2 閾值循環(huán)數(shù)測(cè)量結(jié)果次數(shù)測(cè)量點(diǎn)閾值循環(huán)數(shù)測(cè)量結(jié)果12345678910實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀A111.3411.3711.2311.5611.5611.6411.7311.7611.2811.77A411.5511.7511.5611.2411.8411.3811.4211.3611.3711.35A711.5011.2411.2411.6311.7311.3711.5711.3711.5411.57A1011.2311.7311.6411.2511.5311.5611.3511.3611.6911.37A1211.7811.2711.2511.0711.6511.3711.3311.8311.5311.74D111.3311.7511.7311.8411.2411.8711.7311.5511.4811.35D711.4511.2311.2411.2511.2611.3811.2911.5811.3711.38D1211.7711.8911.5711.6411.5211.9711.2911.3811.4611.46E411.2411.6411.8511.2811.7311.6311.7811.4711.3611.56E1011.9611.8611.9511.8411.3711.6811.7311.2911.7411.37H111.7511.2211.3511.3411.7411.2511.4711.2811.2611.66H411.3511.4511.6711.6611.2711.3711.6711.7811.7311.33H711.7611.7611.2411.6311.8311.4211.3611.5611.3811.34H1011.3211.5511.1111.3211.5511.5311.3711.3711.3311.37H1211.7711.3411.7411.7711.4411.6211.8311.8311.1111.38光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器A111.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50A411.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50A711.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50A1011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50A1211.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50D111.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50D711.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50D1211.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50E411.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50E1011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50H111.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50H411.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50H711.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50H1011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50H1211.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50合并樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差按公式（C.2）計(jì)算：m n 2(ykj2S jk

yj)

（C.4）p m(n1)式中：m——測(cè)量點(diǎn)的數(shù)量；n——每個(gè)測(cè)量點(diǎn)測(cè)量次數(shù)；ykj——jk次的測(cè)量值，℃；yj——j個(gè)測(cè)量點(diǎn)測(cè)量值的平均值，℃；通過(guò)（C.4）Ct值合并樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差Ct值合并樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差Sps如下：

和PCR擴(kuò)增光學(xué)模擬器的Spq=0.0421℃因此重復(fù)測(cè)量引入的不確定度分量u1u10.0421

Sps=01光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器分辨力引入的不確定度分量u'1PCR擴(kuò)增光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器的分辨力為0.01，分散區(qū)間半寬為0.005，按均勻分布計(jì)算，則1u'1

0.00530.0053由于重復(fù)測(cè)量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u1大于分辨力引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量1u'，兩者具有一定的相關(guān)性，因此在不確定度計(jì)算時(shí)不考慮由讀數(shù)分辨力引入的標(biāo)準(zhǔn)11不確定度分量u'。1標(biāo)準(zhǔn)器具引入的不確定度u2針對(duì)光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器，需要考慮其溫度傳感器最大允許誤差引入的不確定度分量uT和發(fā)射光發(fā)生器發(fā)光強(qiáng)度測(cè)量不確定度引入的不確定度分量uL。光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器溫度傳感器的最大允許誤差±0.1℃，最小溫度測(cè)量點(diǎn)30℃時(shí)引入的不確