白介素8對兔腹主動脈粥樣硬化狹窄的影響

1/1白介素8對兔腹主動脈粥樣硬化狹窄的影響白介素8對兔腹主動脈粥樣硬化狹窄的影響作者：

齊曉勇孟存良李英肖黨懿劉惠良王天紅袁華兵倪艷輝劉光武振朝郜利會【摘要】目的觀察白介素8（IL8）水平對兔腹主動脈粥樣硬化狹窄的影響。

方法新西蘭大白兔36只隨機分為實驗組、IL8單克隆抗體治療組、對照組。

實驗組和治療組動物通過穿刺股動脈送入球囊拉傷腹主動脈。

治療組動物通過耳緣靜脈注射IL8單克隆抗體進行干預。

對照組動物只進行股動脈穿刺和留置鞘管，不進行球囊擴張拉傷。

分別于實驗前,實驗后4h、1d、3d，1w、2w、4w，耳緣靜脈采血4ml，檢測三組動物血清IL8水平，4w后處死動物進行病理組織學檢查，應用光學顯微鏡和計算機病理圖像分析系統(tǒng)分析測定以下指標：

內(nèi)膜中膜厚度、面積，計算血管狹窄程度。

結(jié)果實驗組動物球囊損傷4h后IL8水平即開始升高，術(shù)后1d達到峰值，持續(xù)增高4w，且明顯高于治療組和對照組。

治療組和對照組動物IL8水平無上述變化規(guī)律。

實驗組動物腹主動脈明顯狹窄，組織學檢查內(nèi)膜面積和中膜面積、血管狹窄程度等指標大于治療組和對照組（Plt;0.01），治療組管腔狹窄，對照組動物管腔無明顯變化，治療組與對照組比較無顯著性差異(Pgt;0.05)。

相關(guān)分析顯示，IL8水平與內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜面積、中膜厚度、中膜面積等呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r分別為0.894，0.783，0.801，0.912，均Plt;0.01)。

結(jié)論IL8水平高表達引起腹主動脈粥樣硬化狹窄的產(chǎn)生，經(jīng)IL8單克隆抗體治療后動脈狹窄程度明顯減輕。

IL8水平與動脈狹窄程度呈正相關(guān)，是發(fā)生腹主動脈粥樣硬化狹窄的獨立危險因素。

【關(guān)鍵詞】腹主動脈；動脈粥樣硬化；炎性反應；白介素8；單克隆抗體【Abstract】ObjectiveToobservetheeffectsofinterleukin8(IL8)onatherosclerosis(AS)ofabdominalaortainrabbits.MethodsThirtysixNewZealandwhiterabbitswererandomlydividedintoexperiment,treatmentandcontrolgroups,eachgroup12cases.Rabbitsinexperimentandtreatmentgroupswereinjuriedinabdominalaortabyballooninflationafterpuncturedinfemoralartery.MonoclonalantibodyofIL8wasinjectedbyvenousinrabbitsoftreatmentgroup.Rabbitsincontrolgroupwerepuncturedonlyinfemoralartery.Peripheralbloodwascollectedbeforeexperimentand4h,1,3d,1,2,4wlater.ThelevelofIL8wasmeasuredbyenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)respectively.Theluminalsofabdomialaortainthreegroupswereobserved4wlater.Histopathologicexaminationwasperformed.Suchcontentsasfollowswereassayedbylightmicroscopeandcomputerimageanalysissystem:luminalarea,intimaandtunicamediaarea,angiostenosisofbloodvessel.ResultsThelevelofIL8wasraisedin4handachievedtopeakin1dafterballooninflationinrabbitsofexperimentgroup.Thehigherlevelofthisinflammatoryfactorlasted4w.Therewasnovariationaboveintreatmentandcontrolgroups.Itwasobservedthatabdominalaortabecamestenosisobviouslyinexperimentgroup.Theareaofintimaandtunicamediaaswellastheextentofstenosisinexperimentgroupwerebiggerthanthoseintreatmentandcontrolgroups.Therewasnostatisticaldifferencebetweentreatmentandcontrolgroups.CorrelationanalysisindicatedthattherewerepositiverelationsbetweenIL8andthickness,areaofintimaandtunicamediasrespectively(r=0.894，0.783，0.801，0.912，Plt;0.01).MultipleregressionanalysisofLogisticindicatedthatIL8wasanindependentriskfortheAS（Plt;0.01）.ThehighlevelsofIL8leadedtoASinabdominalaortaofrabbits.TheseverityofstenosisbecamelessenafterinterventionbymonoclonalantibodyofIL8.PositivecorelationwasfoundbetweenthelevelofIL8andseverityofarterialstenosis.IL8wasoneofindependentrisksfactorleadingoccurrenceanddevelopmentofAS.ConclusionsThehighlevelsofIL8leadstoASinabdominalaortaofrabbits.TheseverityofstenosisbecomeslessenafterinterventionbymonoclonalantibodyofIL8.PositivecorelationisfoundbetweenthelevelofIL8andseverityofarterialstenosis.IL8isoneofindependentrisksfactorleadingoccurrenceanddevelopmentofAS.【Keywords】Abdominalaorta;Atherosclerosis;Inflammatoryreaction;Interleukin8;Monoclonalantibody目前研究已經(jīng)證實，炎性反應在動脈粥樣硬化（AS）的發(fā)生與發(fā)展中起到重要的作用。

參與AS形成的炎性因子眾多，且互相影響，因此觀察炎性因子的變化規(guī)律，了解炎性因子與AS病變的關(guān)系與作用機制，有助于尋找臨床干預AS的新方法。

白細胞介素8（Interleukin8，IL8）是體內(nèi)重要的炎性因子，可促使血液中單核細胞聚集到內(nèi)膜上及向內(nèi)膜下轉(zhuǎn)移。

本研究擬采用IL8單克隆抗體進行干預治療，觀察干預治療后IL8水平變化以及對腹主動脈AS狹窄的影響，為臨床治療AS性疾病提供新思路。

1材料與方法1.1動物與分組選取8～12月齡新西蘭大白兔36只，雌雄不拘，體質(zhì)量2.50～3.25kg，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供(許可證號：

SCXK(冀)20031003)。

以上實驗動物隨機分為球囊拉傷組（實驗組,n=12）和IL8單克隆抗體干預組（治療組,n=12）以及對照組（n=12）。

1.2方法1.2.1兔腹主動脈AS模型的建立實驗動物術(shù)前12h禁食，不禁水，稱體重。

常規(guī)建立耳緣靜脈輸液通路，以10g/L戊巴比妥鈉3.0～3.5ml/kg耳緣靜脈注射麻醉實驗動物，麻醉后動物仰臥固定于手術(shù)臺，以20%硫化鈉雙側(cè)腹股溝脫毛。

常規(guī)消毒鋪巾后，seldinger技術(shù)穿刺股動脈并留置鞘管，經(jīng)鞘管注入普通肝素200單位抗凝，沿導引鋼絲逆行插入球囊，連接手推式壓力表，造影后將球囊定位，置于髂動脈以上2個椎體處，以405.30～607.95kPa壓力擴張球囊，同時注射造影劑證實球囊完全擴張堵閉腹主動脈，自近心端緩慢回拉(拉傷長度4cm)，反復3次，每次球囊擴張持續(xù)時間20s，每次間隔15s，撤出球囊，拔除動脈鞘管，壓迫止血15min后，繃帶包扎固定，4h后解除繃帶包扎。

1.2.2IL8單克隆抗體的干預治療干預組動物實驗前開始通過耳緣靜脈注射IL8單克隆抗體2mg/kg，連續(xù)3d。

1.2.3病理學檢查剝離腹主動脈大體標本（胸主動脈至髂動脈分叉處）。

剪除血管外結(jié)締組織及脂肪，生理鹽水沖洗殘血。

截取成形部位及對照組血管標本，立即放入10%福爾馬林溶液內(nèi)浸泡固定。

常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋，制成3m厚連續(xù)切片24h，給予蘇木素伊紅（HE）染色。

利用HE染色的切片，隨機選取5個視野，在40倍光鏡下，利用微機圖像處理測量系統(tǒng)對切片進行圖像攝取和轉(zhuǎn)換，測量斑塊纖維帽及新生內(nèi)膜厚度（IT）、中膜厚度(MT)、內(nèi)膜面積(IA)、中膜面積(MA)，計算血管狹窄程度、IT/MT比值，以及IA/MA比值。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0軟件包完成統(tǒng)計處理，先進行組間均衡性檢驗，計量資料以xs表示，采用2檢驗。

先行方差分析，然后再作多組均數(shù)的q檢驗，相關(guān)資料采用相關(guān)分析法計算相關(guān)系數(shù)，并進行多元Logistic回歸分析。

2結(jié)果2.1三組實驗動物之間體重、月齡、性別、血脂等一般情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05），見表1。

表1三組動物一般情況比較(略)2.2三組動物術(shù)前、術(shù)后IL8水平比較術(shù)前三組IL8水平無明顯差異；術(shù)后4h實驗組IL8水平較術(shù)前以及干預組和對照組明顯升高，術(shù)后1d達到峰值，持續(xù)增高4w。

干預組與治療組無上述變化趨勢，干預組顯著低于實驗組（Plt;0.01），與對照組比較，無顯著性差異(Pgt;0.05)，見表2。

表2三組之間不同時間點IL8水平(略)2.3三組動物病理形態(tài)學改變HE染色可見對照組動脈內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮下有少量結(jié)締組織，無平滑肌細胞存在，中膜平滑肌細胞成梭形，環(huán)繞管腔排列；實驗組兔內(nèi)膜、中膜明顯增厚，管腔明顯狹窄，內(nèi)膜下平滑肌細胞明顯增生，而且排列不規(guī)則，內(nèi)皮及內(nèi)皮下層水腫變性，彈性纖維層結(jié)構(gòu)不清，斑塊隆起明顯，內(nèi)含大量泡沫細胞；治療組內(nèi)膜、中膜亦有不同程度的增厚，管腔有所狹窄，較多中膜平滑肌細胞增生遷移至內(nèi)膜下，但增生以及狹窄程度均明顯輕于模型組。

見圖1。

表3三組之間動脈狹窄程度、內(nèi)膜中膜厚度面積比較(略)2.4三組之間動脈狹窄程度、IT、MT、IA、MA比較實驗組與治療組和對照組比較，動脈狹窄程度、IT、、MT、TA、MA顯著增高（Plt;0.01），治療組雖高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)。

見表3。

表4腹主動脈狹窄的多元回歸分析(略)2.6腹主動脈狹窄的多元回歸分析以術(shù)后腹主動脈是否發(fā)生＞50%狹窄為因變量，月齡、術(shù)前體重、術(shù)后體重，術(shù)前、后甘油三酯（TG），術(shù)、前后總膽固醇（TC），術(shù)前、后高密度脂蛋白膽固醇（HDLC），術(shù)前、后低密度脂蛋白膽固醇（LDLC），術(shù)前、后各個時間點IL8水平等均作為自變量，進行多元Logistic逐步回歸分析，發(fā)現(xiàn)進入模型的變量為術(shù)后1dIL8水平，其對于腹主動脈狹窄發(fā)生的危險性比值（RR）為1.674（95%可信區(qū)間1.164～2.530，P=0.001）。

表明術(shù)后IL8峰值為腹主動脈狹窄發(fā)生的獨立危險因素，見表4。

3討論炎性反應在AS中的作用越來越受到人們重視，AS形成的炎癥學說〔1〕認為，炎癥是AS發(fā)病的重要原因，參與AS斑塊的形成、破裂及血栓形成，各階段均出現(xiàn)血管損傷的炎性反應〔2〕。

炎癥反應可同時存在于斑塊局部及全身炎癥系統(tǒng)。

研究已經(jīng)證明IL8等趨化因子及其特異性受體在AS中起重要作用〔3〕。

IL8主要來源于單核巨噬細胞、中性粒細胞和內(nèi)皮細胞等，可刺激C反應蛋白（CRP）、血清淀粉樣蛋白A(SAA)、血管細胞黏附分子1（VCAM1）表達，并抑制金屬蛋白酶抑制因子（TIMP）的活性，加強氧化應激和細胞凋亡等，導致患者臨床表現(xiàn)不穩(wěn)定。

組織中高濃度的IL8可以增強中性粒細胞黏附、移行，而循環(huán)中的IL8阻止中性粒細胞的游走并黏附于內(nèi)皮細胞〔4，5〕，研究表明在凝血因子激活和細胞活素級聯(lián)之間，IL8是二者相互作用的一個關(guān)鍵因素。

Rornuk等〔6〕研究冠心病患者的血漿IL8水平變化，發(fā)現(xiàn)不穩(wěn)定型心絞痛患者的血IL8水平明顯高于穩(wěn)定型心絞痛患者和對照組，提示IL8在一定程度上反映冠狀AS斑塊的穩(wěn)定性。

IL8的釋放可能是心絞痛患者冠狀動脈病變局部炎性激活和凝血異常反應的標志，也是冠狀動脈病變不穩(wěn)定的信號。

研究證實〔7〕，心絞痛（UA）患者血漿IL8表達在A型、B型、C型病變組依次增加，并與冠狀動脈狹窄直徑呈正相關(guān)。

有研究證實，AS形成過程中IL8可以吸引T淋巴細胞，同時它也是血管生長因子，能誘導平滑肌細胞(SMC)增殖、移行〔8〕，對中性粒細胞有激活作用，可誘導其變形、趨化、脫顆粒、胞質(zhì)內(nèi)鈣短暫上升等。

此外，IL8也可以對T淋巴細胞和嗜堿性粒細胞有趨化作用，因此，IL8在炎癥局部發(fā)揮了重要的作用〔9〕。

Koch等〔10〕研究認為，IL8可能通過其血管生長因子特性參與AS的病理過程。

Rus等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)AS管壁中IL6和IL8的蛋白和基因表達都比正常管壁中高。

聶永梅等〔12〕通過建立AS模型,動態(tài)監(jiān)測了整個AS過程中IL8的蛋白和基因表達，發(fā)現(xiàn)IL8的蛋白和基因上調(diào)主要是在高脂血癥家兔AS模型的脂紋期。

由此可見，AS與IL8的升高密切相關(guān)。

IL8和黏附分子家族中的重要成員VCAM1參與了AS的形成過程〔13，14〕。

IL8能刺激中性粒細胞、T細胞趨化、游走，而且和MCP1一起促進牢固的單核細胞附壁〔15〕。

有研究表明，IL8可以誘導單核細胞黏附到血管內(nèi)皮，而單核細胞和內(nèi)皮細胞之間的黏附可以誘導二者的激活，使其在無需其他刺激的情況下就能產(chǎn)生IL8，加劇了局部的炎癥病變〔16，17〕。

在轉(zhuǎn)基因高TC血癥的老鼠敲除了IL8的趨化因子受體（CXCR）2，可以縮小AS斑塊〔18〕。

本文前期研究中發(fā)現(xiàn)，兔腹主動脈球囊擴張術(shù)后引起炎性反應的發(fā)生與增強，在參與其中的炎性因子中，包括IL8、IL6、TNF、CRP等，IL8最先升高，達峰值時間最短，相關(guān)分析顯示IL8水平與IL6等表達呈正相關(guān)。

推測在上述炎性反應中，IL8可能起到了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。

在本研究中，球囊損傷兔腹主動脈后引起IL8水平的高表達，實驗組顯著高于對照組，同時腹主動脈狹窄程度、IT及MT、IA及MA等明顯增加。

在兔球囊擴張術(shù)后進一步采用IL8單克隆抗體經(jīng)耳緣靜脈注射干預治療后，IL8水平與實驗組比較顯著下降，峰值消失。

病理檢查結(jié)果顯示，腹主動脈狹窄程度以及IT、MT、IA及MA和上述二者的比值等指標均明顯下降，與對照組比較無顯著性差異。

直線相關(guān)分析顯示，IL8水平與上述動脈狹窄指標均呈正相關(guān)，多元Losgitic回歸分析表明，IL8水平是引起腹主動脈狹窄的獨立危險因素，說明IL8在引起AS發(fā)展的病理進程中，起到了關(guān)鍵作用。

綜上所述，本研究證實了IL8和AS病變之間的關(guān)系，提示IL8單克隆抗體治療可有效降低IL8水平，抑制炎性反應激活程度，阻遏AS的發(fā)展，有必要進行下一步的深入研究，為臨床干預治療AS性疾病尋找新的治療方向。

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