不同灸法對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎調(diào)節(jié)機(jī)制的研究

1/1不同灸法對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎調(diào)節(jié)機(jī)制的研究（不同灸法對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎調(diào)節(jié)機(jī)制的研究#崔云華1，吳煥淦1，劉慧榮1，周爽1,2，萬華3，王曉梅1，華雪桂1，崔學(xué)軍1**（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海200030；2.第二軍醫(yī)大學(xué)中醫(yī)系，上海200433；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海200021）摘要：

目的:探討不同灸法對(duì)UC大鼠的影響,以及對(duì)COX-2、Bcl-2、Bax表達(dá)及PGE2的含量的影響。

方法:采用免疫學(xué)方法，并加局部刺激制備實(shí)驗(yàn)性UC大鼠模型。

造模后采用不同灸法治療14次，處死動(dòng)物取材，用免疫組化法檢測(cè)COX-2、Bcl-2、Bax，用放射免疫法測(cè)定PGE2含量。

結(jié)果:（1）UC模型大鼠結(jié)腸組織COX-2、Bcl-2的表達(dá)和PGE的含量顯著高于正常大鼠(Ｐ0.01),而Bax的表達(dá)顯著低于正常大鼠(Ｐ0.01)；（2）經(jīng)過不同灸法治療后,與模型對(duì)照組比較各治療組COX-2、Bcl-2的表達(dá)和PGE2的含量均顯著降低(Ｐ0.01)。

（3）在下調(diào)PGE2含量、Bcl-2的表達(dá)和下調(diào)COX-2表達(dá)陽性面積、強(qiáng)度以及免疫組化指數(shù)方面，隔姜灸組、隔蒜灸組調(diào)節(jié)作用優(yōu)于溫和灸組。

(Ｐ0.01，Ｐ0.05，Ｐ0.01)結(jié)論:不同艾灸干預(yù)可抑制UC機(jī)體結(jié)腸組織COX-2、Bcl-2的表達(dá)和降低PGE2的含量，調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax的比例關(guān)系；艾柱間接灸法（隔姜灸、隔蒜灸）治療潰瘍性結(jié)腸炎優(yōu)于溫和灸。

關(guān)鍵詞：

針灸推拿學(xué)；潰瘍性結(jié)腸炎；灸法；COX-2；Bcl-2/Bax；實(shí)驗(yàn)研究中圖分類號(hào)：

R245.815101520ResearchonRegulatoryMechanismofDifferentMoxibustionTherapyforUCRatCUIYunhua1,WUHuangan1,LIUHuirong1,ZHOUShuang1,2,WANHua3,WANGXiaomei1,HUAXuegui1,CUIXuejun1(1.ShanghaiInstituteofAcupuncture-moxibustionandMeridians,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,ShangHai200030;2.SchoolofTraditionalChineseMedicine,SecondMilitaryMedicalUniversity,ShangHai200433;3.ShuguangHospitalaffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,ShangHai200021)Abstract:ObjectiveInordertocompareeffectofdifferentmoxibustiontherapyonUC,observetheeffectofdifferentmoxibustiontherapyonexpressionofCOX-2、Bcl-2、BaxandcontentofPGE2.MethodsUCRatmodelwassetupbyimmunologicalmethodandregionalexcitation.Afterthemodelwassetup,14treatmentsweregivenwithdifferentmoxibustiontherapyonUC.COX-2、Bcl-2、BaxweredetectedbyimmunologicalhistochemistryandPGE2wasdetectedbyradio-immunityafterexecutingtherats.Results(1)ExpressionofCOX-2、Bcl-2、BaxandcontentofPGE2ofcoloninUCmodelratsaresignificantlyhigherthanthatinnormalrats.(Ｐ0.01)ExpressionofBaxofcoloninUCmodelratsislowerthanthatinnormalrats.(Ｐ0.01)(2)Afterdifferentmoxibustiontherapy,expressionofCOX-2、Bcl-2andcontentofPGE2ofcoloninUCratsweresignificantlylowerbycomparingwithcontrolgroup.(Ｐ0.01)(3)ginger-partitionmoxibustiongroupandgarlic-partitionmoxibustionisbettereffectthanwarmingmoxibustiongroupondownregulationofexpressionofPGE2、Bcl-2andpositiveareaofCOX-2.(Ｐ0.01，Ｐ0.05，Ｐ0.01)ConclusionsExpressionofCOX-2、Bcl-2、BaxandcontentofPGE2ofcoloncanbeinhibitedandcontentofPGE2canbedownregulatedandratioofBcl-2andBaxcanberegulatedbydifferentmoxibustiontherapy.Moxaconeindirectmoxibustion基金項(xiàng)目：

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（200802680001）作者簡(jiǎn)介：

崔云華，（1973-），女，副研究員，主要研究方向：

針灸效應(yīng)機(jī)制研究。

通信聯(lián)系人：

周爽，1972-），女，副教授，主要研究方向，針灸作用機(jī)理研究。

E-mail:szhouwork@-1-2530354045采用隔藥灸治療潰瘍性結(jié)腸炎取得了較好的效果。

隔藥灸僅是艾therapy(ginger-partitionmoxibustionandgarlic-partition)isbettereffectthanwarmingmoxibustionontreatingUC.Keywords:AcupunctureandMoxibustionandTuinaofChinesemedicine;UC;moxibustiontherapy;COX-2;Bcl-2/Bax;experimentalstudy500引言筆者以往的研究[1-3等],柱間接灸法的一種，針灸臨床上常用的艾柱間接灸法還有隔姜灸、隔蒜灸等。

本實(shí)驗(yàn)擬探討隔姜灸、隔蒜灸及溫和灸等不同灸法對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的作用差異,為隔姜灸、隔蒜灸及55溫和灸治療潰瘍性結(jié)腸炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1材料與方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組1.1雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體重140g20g，50只，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

所有動(dòng)物購回后飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物室，室溫2310℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)60一周，無不良反應(yīng)，飲食、飲水正常者，即納入實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、隔姜灸組、隔蒜灸組、溫和灸組，每組各10只。

實(shí)驗(yàn)主要試劑1.2兔抗大鼠COX-2單克隆抗體、兔抗大鼠Bcl-2單克隆抗體、兔抗大鼠Bax單克隆抗體、羊抗兔SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒（以上均為Boster,Wuhan公司提供），PGE2RIAKit65（蘇州醫(yī)學(xué)院提供），DEPC（Sigma,USA提供），TRIzol試劑（GibcoBRL,USA提供），三氯甲烷（上海化學(xué)試劑廠提供）。

實(shí)驗(yàn)主要儀器1.3石蠟切片機(jī)（AO820rotarymicrotome）、OlympusBH2生物顯微鏡（Japan）、Panasonic攝象機(jī)（Japan）、IMS細(xì)胞圖象分析系統(tǒng)（上海申騰信息技術(shù)有限公司）、PT1200細(xì)胞超70聲破碎儀（Switzerland）、AEL-200精密電子天平（Shimadaz,Japan）低溫高速離心機(jī)（Heraeus,Germany）、SH-682放射免疫計(jì)數(shù)器（原子核所）、可調(diào)移液器(1000l,200l,40l,10l)（Finnpiprettes(Labsystems)）、1.5ml離心管及0.5ml薄壁PCR管(USA)、J-30I高速冷凍離心機(jī)（Beckman,USA）、320pHMeter（Beckman,USA）。

1.4造模方法75采用人體術(shù)后的新鮮結(jié)腸粘膜，加適量生理鹽水制成粘膜勻漿，冷凍24h，溶凍后以3000r/min離心30min，取上清液提純測(cè)定蛋白質(zhì)含量，并與Freund佐劑混合配成乳劑。

除正常組外其他各組大鼠首次每只足趾內(nèi)注射抗原3mg，并在10d，17d，24d，31d分別于足趾、背部、腹股溝、腹腔內(nèi)注射抗原6mg（末次注射不加Freund佐劑），至血清抗結(jié)腸抗體達(dá)到一定效價(jià)，對(duì)造模大鼠用2%戊巴比妥鈉30mg/kg行腹腔內(nèi)注射麻醉，用3%福爾馬80林2ml灌腸，留置1h，以生理鹽水洗凈后排出，再用抗原液（10mg/ml不加佐劑）2ml灌腸，留置2h，洗凈排去。

正常組大鼠用生理鹽水作與造模各組相同處理。

-2-1.5處理方法用材：

特制細(xì)艾條。

新鮮蒜、姜切取直徑0.5cm，厚0.3cm片，中穿數(shù)孔備用。

選穴[4]：

取天樞穴（雙）、氣海穴。

天樞定位相當(dāng)于臍中旁開0.5cm左右,氣海定位臍下1.0cm處。

85治療方法：

正常組：

不做任何治療。

模型組：

只作與各治療組相同的抓取固定，而不做任何治療。

溫和灸組：

每穴懸灸。

隔姜灸組：

每穴隔姜灸2壯。

隔蒜灸組：

每穴隔蒜灸2壯。

療程：

每次每穴10min，每日1次，共灸14次。

樣本制備1.6于治療結(jié)束后次日斷頭處死各組大鼠，剖開腹腔，切取遠(yuǎn)端結(jié)腸，用預(yù)冷的4℃生理鹽90水漂洗，濾紙吸干，稱取200mg左右，置于冰浴中盛有生理鹽水的勻漿器中，進(jìn)行組織粉碎勻漿后，37℃保溫15min，3500rpm離心15min，將上清液移入Ep管，-20℃保存?zhèn)錅y(cè)PGE2。

另取3-4cm置10%福爾馬林中固定備COX-2、Bcl-2、Bax免疫組化檢測(cè)。

1.71.7.1COX-2、Bcl-2、Bax表達(dá)的測(cè)定95觀察指標(biāo)與測(cè)定方法按免疫組化染色SABC法（StreptomycesAvidinBiotin-PeroxidaseComplextechnique）常規(guī)步驟操作，具體如下：

(1)標(biāo)本石蠟包埋、切片5m厚。

常規(guī)脫蠟至水。

玻片預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸處理。

(2)將標(biāo)本片置入3％H202中，室溫10min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。

雙蒸水洗，2min3次。

100105110(3)滴加復(fù)合消化液，室溫10min。

雙蒸水洗，2min3次。

(4)滴加抗原修復(fù)液，室溫10min。

雙蒸水洗，2min3次。

(5)滴加正常山羊血清，室溫10min。

吸干液體，不洗。

(6)滴加一抗（兔抗大鼠，工作濃度1：

150）。

置4℃，48h。

0.01MPBS洗，3min3次。

(7)滴加生物素化山羊抗兔IgG，置37℃30min。

0.01MPBS洗，3min3次。

(8)滴加SABC，置37℃30min。

0.01MPBS洗，3min3次。

(9)DAB顯色。

(10)蘇木素輕度復(fù)染。

(11)脫水、透明、封片。

同時(shí)設(shè)陰性替代片做對(duì)照：

用正常山羊血清代替一抗。

陽性染色呈棕黃色，陰性對(duì)照片無陽性染色。

每張切片隨機(jī)采集3個(gè)不同視野，運(yùn)用IMS細(xì)胞圖象分析系統(tǒng)檢測(cè)陽性表達(dá)面積與強(qiáng)度，取平均值進(jìn)行分析。

并通過陽性表達(dá)面積強(qiáng)度計(jì)算IHC陽性指數(shù)PGE2含量測(cè)定1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理1.7.2115PGE2含量測(cè)定用放射免疫法，具體操作依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

數(shù)據(jù)用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（xs）表示，運(yùn)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)比較采用F、q檢驗(yàn)。

-3-108.1619.39**109.1414.82**114.0920.12*12496.9322956.800*10702.543985.164*15007.5242499.152*21262.6192205.682*16.850.77*△14.470.69*217110.8037982.07*357886.0136639.53*152350.7739689.38*△132373.8715654.10*△2結(jié)果2.1120不同灸法對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸PGE2含量的影響表2-1各組大鼠結(jié)腸PGE2含量的比較（pg/ml,xs）NPGE2-14組別1092.2010.18正常組9130.9818.37*模型組隔姜灸組隔蒜灸組溫和灸組101010△△△△注：

與正常組比較，*p0.01,**p0.05；與模型組比較，▲▲p0.05；與隔蒜灸組比較，p0.01,△△p0.05；與隔姜灸組比較，▲p0.01,p0.01,

p0.05（以下各表同此）125從表2-1可見，模型組大鼠結(jié)腸PGE2含量與正常組比較顯著上調(diào)（P0.01），隔姜灸組、隔蒜灸組、溫和灸組大鼠經(jīng)治療后，PGE2含量顯著下調(diào)，與模型組比較均有顯著差異（P0.05，P0.01）。

不同灸法對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸COX-2表達(dá)的影響2.2130表2-2各組大鼠結(jié)腸COX-2表達(dá)的比較（xs）組別正常組模型組隔姜灸組隔蒜灸組溫和灸組N109101010陽性面積（m2）強(qiáng)度6068.3751183.2996.830.95IHC指數(shù)41808.6312243.36△12.201.24*△12.370.94*△▲

▲

▲

圖1正常組（IHC200）圖2模型組（IHC200）-4-12702.4612100.410*12320.8032136.528*14541.6972548.895*圖3圖5溫和灸組（IHC200）隔蒜灸組（IHC200）圖4隔姜灸組（IHC200）從表2-2、圖15可見，模型組大鼠結(jié)腸COX-2表達(dá)在陽性面積、強(qiáng)度，以及免疫組化指數(shù)與正常組比較均與顯著差異（p0.01），隔姜灸組、隔蒜灸組、溫和灸組大鼠經(jīng)治療后，COX-2表達(dá)陽性面積、強(qiáng)度，以及免疫組化指數(shù)顯著下調(diào)，與模型組比較均與顯著差異135（p0.01）,其中隔姜灸組、隔蒜灸組調(diào)節(jié)作用優(yōu)于溫和灸組（p0.01）。

不同灸法對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸Bcl-2表達(dá)的影響2.3表2-3各組大鼠結(jié)腸Bcl-2表達(dá)的比較（xs）組別正常組模型組隔姜灸組隔蒜灸組溫和灸組N109101010陽性面積（m2）強(qiáng)度9883.785610.8619.400.6625911.9472070.497*17.301.71*△IHC指數(shù)92993.679981.80448461.3760069.37*152710.5529241.90*△140803.7324462.38*△194515.7639021.02*▲

△▲▲

12.000.86*△11.430.39*△13.330.98*▲

-5-圖6正常組（IHC200）圖7圖9隔姜灸組（IHC200）模型組（IHC200）圖8溫和灸組（IHC200）圖10隔蒜灸組（IHC200）從表2-3、圖610可見，模型組大鼠結(jié)腸中Bcl-2的表達(dá)在陽性面積、強(qiáng)度、IHC指數(shù)方面均顯著上調(diào)，與正常組比較具有顯著差異（p0.01）；隔姜灸組、隔蒜灸組、溫和灸組140大鼠結(jié)腸中Bcl-2的表達(dá)明顯下調(diào)，與模型組比較具有顯著差異（p0.01），其中隔姜灸組、隔蒜灸組效果尤佳，與溫和灸組比較差異具有顯著性（p0.05，p0.01）。

-6-2.4不同灸法對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸Bax表達(dá)的影響表2-4各組大鼠結(jié)腸Bax表達(dá)的比較（xs）組別正常組模型組隔姜灸組隔蒜灸組溫和灸組N109101010陽性面積（m2）26972.6153326.58818.271.3515415.2791376.144*13.001.01*16641.8191956.204*13.370.97*16659.8792301.175*13.331.08*15987.1692597.220*12.931.25*強(qiáng)度IHC指數(shù)493437.2679193.54200150.7722244.43*223032.8935356.53*221513.0131081.03*206171.5036973.80*圖11正常組（IHC200）圖13溫和灸組（IHC200）隔蒜灸組（IHC200）圖12模型組（IHC200）圖14隔姜灸組（IHC200）圖15145從表2-4、圖1115可見，模型組大鼠結(jié)腸中Bax的表達(dá)在陽性面積、強(qiáng)度、IHC指數(shù)-7-廣應(yīng)用等打下良好基礎(chǔ)。

筆者以往的研究[1-3]采用隔藥灸治療潰瘍性結(jié)腸炎取得了較好的效果。

而隔藥灸是艾柱間接灸法的一種，針灸臨床上常用的艾柱間接灸法還有隔姜灸、隔蒜灸瘍性結(jié)腸炎的作用優(yōu)于溫和灸。

這說明除了隔藥灸[1-3,]外，隔姜灸、隔蒜灸這些艾柱間接法治療潰瘍性結(jié)腸炎同樣可以取得較好療效。

此進(jìn)一步表明：

在治療潰瘍性結(jié)腸炎上，艾柱間接灸法優(yōu)于溫和灸。

間接灸不僅能發(fā)揮艾灸的作用，而且還能發(fā)揮所用藥物的藥理作用。

間方面均顯著下調(diào)，與正常組比較具有顯著差異（p0.01）；隔姜灸組、隔蒜灸組、溫和灸組對(duì)Bax表達(dá)的影響在IHC指數(shù)方面與模型組均無顯著差異。

3討論150155160165170175180灸法，是針灸學(xué)中重要的治療手段之一，由于各種主客觀原因的制約，自近代以來，歷史上曾鼎盛發(fā)展且療效確切的灸療技術(shù)遇到了新的阻力和困難，國(guó)內(nèi)重針輕灸、或只針不灸、國(guó)外有針無灸的現(xiàn)狀，迫切需要開展灸法臨床與基礎(chǔ)研究，為提高灸法臨床療效，推等等。

因此從不同灸法的角度進(jìn)一步探討隔姜灸、隔蒜灸及溫和灸對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的作用具有重要意義。

COX-2在正常結(jié)腸粘膜表達(dá)很少，而炎癥粘膜上皮細(xì)胞及結(jié)腸固有層單核炎性細(xì)胞大量表達(dá)[5]，說明COX-2的表達(dá)與UC的發(fā)病及病情變化有關(guān)。

COX-2可通過減少AA,增加PGE－2水平來調(diào)節(jié)各種促凋亡和抑凋亡因子的表達(dá)[6]。

Bcl-2是一種抗細(xì)胞調(diào)亡的基因，Bax與Bcl-2作用相反，起促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡的作用。

結(jié)腸黏膜細(xì)胞和炎性細(xì)胞的凋亡程序的紊亂與UC的發(fā)病和病情有直接的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果UC模型大鼠結(jié)腸組織COX-2、Bcl-2的表達(dá)和PGE的含量顯著高于正常大鼠(Ｐ均0.01),而Bax的表達(dá)顯著低于正常大鼠(Ｐ均0.01)。

表明實(shí)驗(yàn)性UC大鼠COX-2、Bcl-2的表達(dá)和PGE的含量上調(diào),結(jié)合組織病理學(xué)觀察UC模型大鼠結(jié)腸黏膜可見充血、水腫、糜爛、潰瘍,提示COX-2、Bcl-2的表達(dá)和PGE的含量與實(shí)驗(yàn)性UC的發(fā)生密切相關(guān)。

經(jīng)過天樞穴（雙）、氣海穴進(jìn)行灸療后,與模型對(duì)照組比較各治療組COX-2、Bcl-2的表達(dá)和PGE-2的含量均顯著降低(Ｐ均0.01),結(jié)腸黏膜潰瘍面損傷修復(fù),表明艾灸取效與其抑制結(jié)腸組織COX-2、Bcl-2的表達(dá)和PGE的含量有關(guān)。

雖然治療后Bax的表達(dá)與模型組無明顯差異，但通過治療使Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，從而改變了Bcl-2/Bax的比例關(guān)系，使細(xì)胞調(diào)亡趨于正常而達(dá)到治療UC的目的。

通過不同灸法對(duì)UC模型大鼠的治療說明了灸療的有效性，并說明不同灸療的作用能夠使患病機(jī)體的發(fā)病基因發(fā)生變化。

所以，灸療不僅僅是改善疾病的臨床癥狀，而且能引起機(jī)體某些基因發(fā)生改變，從而達(dá)到治療疾病的目的。

本研究在下調(diào)PG