DB37T-海水中7種三嗪類除草劑的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法編制說明

《海水中7種三嗪類除草劑的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》地方標(biāo)準(zhǔn)編制說明一、工作簡況（一）任務(wù)來源2020年7月30日，山東省市場監(jiān)督管理局《關(guān)于印發(fā)2020年度地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃項(xiàng)目的通知》（魯市監(jiān)標(biāo)函〔2020〕249號），《海水中三嗪類除草劑殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》系列標(biāo)準(zhǔn)被列入地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃，計(jì)劃編號為2020-219。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省海洋局提出并組織實(shí)施，由山東省海洋標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。（二）起草單位、起草人及任務(wù)分工1．主要起草單位本文件由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所起草制定。主要負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的整體性推進(jìn)工作，包括標(biāo)準(zhǔn)方案的制定、標(biāo)準(zhǔn)方法的建立和標(biāo)準(zhǔn)文本的起草，并負(fù)責(zé)開展標(biāo)準(zhǔn)方法的驗(yàn)證、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，組織專家征求意見，然后根據(jù)反饋意見對標(biāo)準(zhǔn)修改完善。2．主要起草人及任務(wù)分工主要起草人：孫曉杰、李兆新、譚志軍、邢麗紅、郭萌萌、孫偉紅、王聯(lián)珠、李風(fēng)鈴、丁東生、劉云龍。任務(wù)分工如下：孫曉杰：項(xiàng)目主持人，負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容的設(shè)計(jì)、標(biāo)準(zhǔn)起草及驗(yàn)證工作；李兆新：項(xiàng)目組織者，負(fù)責(zé)項(xiàng)目的整體組織實(shí)施；譚志軍：參與調(diào)查研究，標(biāo)準(zhǔn)整體內(nèi)容設(shè)計(jì)等工作；邢麗紅：參與調(diào)查研究、標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容設(shè)計(jì)、標(biāo)準(zhǔn)起草和修改、實(shí)驗(yàn)室分析等工作；郭萌萌：參與調(diào)查研究、實(shí)驗(yàn)室分析等工作；孫偉紅：參與調(diào)查研究、收集資料和標(biāo)準(zhǔn)文本的修改等工作；王聯(lián)珠：參與調(diào)查研究、收集資料和標(biāo)準(zhǔn)文本的修改等工作；李風(fēng)鈴：參與調(diào)查研究、標(biāo)準(zhǔn)文本的修改等工作；丁東生：參與調(diào)查研究、標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證等工作；劉云龍：參與調(diào)查研究、標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證等工作。（三）起草過程標(biāo)準(zhǔn)的制定分以下幾個階段完成。1．第一階段制定實(shí)施方案中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所接到山東省市場監(jiān)督管理局下達(dá)的《海水中三嗪類除草劑殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》標(biāo)準(zhǔn)制定任務(wù)后，立即成立了標(biāo)準(zhǔn)起草小組，2021年1月-3月，查詢國內(nèi)外資料庫，完成有關(guān)資料、檢測技術(shù)的收集，在儀器設(shè)備、試驗(yàn)材料方面做了充分準(zhǔn)備，在此基礎(chǔ)上經(jīng)過反復(fù)討論制定出標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施方案。2.第二階段起草標(biāo)準(zhǔn)文本2021年4月-2021年12月，我們通過優(yōu)化色譜柱類型、流動相種類、梯度洗脫條件確定色譜儀器參數(shù)，繼而通過掃描模式、噴霧電壓、離子對和碰撞能的優(yōu)化確定質(zhì)譜儀器參數(shù)。方法優(yōu)化的重點(diǎn)工作是通過對海水基質(zhì)大量加標(biāo)試驗(yàn)、提取劑篩選、凈化方式比對等工作，建立標(biāo)準(zhǔn)的前處理方法。在此基礎(chǔ)上比較了標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法、基質(zhì)加標(biāo)外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)校正方法對目標(biāo)物的回收率影響，表明內(nèi)標(biāo)定量校正法對所有化合物均有較高的回收率。最終優(yōu)化確定方法的適用性、回收率、精密度及檢出限等參數(shù)：檢出限為5.0ng/L，定量限為20ng/L；西草凈、西瑪津、莠滅凈、莠去津、撲草凈、特丁凈、特丁津在添加濃度5.0ng/L～500ng/L時，回收率均為70%～120%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15％，滿足殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)要求。2022年1-3月，依據(jù)GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第一部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》、GB/T20001.4-2015《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)》對標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了編寫，形成了標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿和編制說明初稿。3.第三階段驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)方法2022年4月-5月，標(biāo)準(zhǔn)起草單位特委托農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（煙臺）、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃渤海區(qū)漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心和天祥（天津）質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公司青島分公司三家單位對方法進(jìn)行了復(fù)核驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果表明：方法的檢出限和定量限分別為5ng/L和10ng/L，所測精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度等指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定要求，適用于海水中三嗪類除草劑的測定。4.第四階段完成征求意見2022年5月-6月，通過電子郵件方式向國家海洋監(jiān)測中心、中國海洋大學(xué)、山東省海洋資源與環(huán)境研究院等單位的30余位專家發(fā)送《征求意見稿》，共收到30余位專家的反饋意見，其中2位專家無意見，28位專家反饋了具體意見，共計(jì)98條。匯總各方意見并對本標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修改，完成了本標(biāo)準(zhǔn)的送審稿。5.第五階段標(biāo)準(zhǔn)論證會2022年7月20日，參加山東省海洋標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會組織的標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)場論證會，來自山東省國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)審評中心、山東省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心、山東師范大學(xué)、中國海洋大學(xué)和青島大學(xué)等單位的多位專家參加會議，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)材料的梳理及現(xiàn)場ppt匯報，針對標(biāo)準(zhǔn)制定過程進(jìn)行討論，后期參照標(biāo)準(zhǔn)論證會專家意見和建議對標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說明進(jìn)行修改和完善。6.第六階段提交平臺系統(tǒng)。2022年12月提交山東省市場監(jiān)督管理局平臺系統(tǒng)，2022年11月-2023年7月，通過主管部門5次技術(shù)審查反饋，進(jìn)行格式修改和內(nèi)容調(diào)整，修改形成正式的標(biāo)準(zhǔn)送審稿。7.第七階段標(biāo)準(zhǔn)評審會。2023年9月14日，召開標(biāo)準(zhǔn)的正式評審會，由山東省海洋標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會組織，來自山東省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心、中國海洋大學(xué)、山東省標(biāo)準(zhǔn)化研究院、中國科學(xué)院海洋研究所、山東省海洋科學(xué)研究院、自然資源部北海生態(tài)中心等單位的多位專家參加會議，針對標(biāo)準(zhǔn)制定過程進(jìn)行討論，后期參照專家意見和建議對標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說明進(jìn)一步修改和完善，最終形成標(biāo)準(zhǔn)報批稿。二、地方標(biāo)準(zhǔn)制定目的和意義三嗪類除草劑(Triazineherbicides)是一類含有3個氮原子的六元雜環(huán)化合物。過去30年期間，因其高效的除草效果，在世界范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用。三嗪類除草劑，被不法養(yǎng)殖戶直接用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，清除魚、蝦、蟹、貝、海參等水體的絲狀藻類（青苔）、大型草類及有害藻類。然而，該類除草劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和水產(chǎn)養(yǎng)殖使用過程中，通過地表徑流和排放進(jìn)入海洋系統(tǒng)，水環(huán)境中殘留的除草劑已然成為生態(tài)環(huán)境污染的主要來源。由于三嗪類除草劑半衰期長、難降解、毒性大，對水生生態(tài)系統(tǒng)和非靶標(biāo)生物的安全造成嚴(yán)重威脅，美國和歐盟等已將其列入內(nèi)分泌干擾物名單。日本針對貝類中撲草凈的最大殘留限量（MRL）要求，參考其他食品執(zhí)行0.01mg/kg的“一律標(biāo)準(zhǔn)”，紫菜中撲草凈限量為0.14～0.19mg/kg。然而包括美國、加拿大和中國等在內(nèi)的多個國家仍沒有海洋環(huán)境和水產(chǎn)品中三嗪類除草劑安全限量(MRL)的相關(guān)規(guī)定，缺乏相應(yīng)的殘留監(jiān)管。三嗪類除草劑不僅對貝類等非靶標(biāo)生物造成嚴(yán)重?fù)p害，而且是我國出口日本貝類產(chǎn)品連續(xù)14批受阻的主要原因，是繼中日兩國紫菜“撲草凈事件”后的又一貿(mào)易爭端，成為我國出口貿(mào)易新的技術(shù)壁壘，也成為國際研究的熱點(diǎn)和管控重點(diǎn)。相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)的制定將有助于海洋環(huán)境的安全監(jiān)管，確保生態(tài)環(huán)境安全和水產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易的順利開展。西瑪津（Simazine）西草凈（Simetryne）莠去津（Atrazine）莠滅凈（Ametryn）特丁津（Terbuthylazine）撲草凈（Prometryn）特丁凈（Terbutryn）圖1西瑪津、西草凈、莠去津、莠滅凈、特丁津、撲草凈以及特丁凈的結(jié)構(gòu)示意圖目前，國內(nèi)適用于食品基質(zhì)的色譜質(zhì)譜檢測法，包括《GB/T18629-2002食品中撲草凈殘留量的測定方法》、《SN/T1968-2007進(jìn)出口食品中撲草凈殘留量檢測方法》和《GB/T23816-2009大豆中三嗪類除草劑殘留量的測定》，檢測對象是蔬菜、水果和糧食等食品，均不適用于海水基質(zhì)。水中三嗪類檢測的國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)有《HY/T147.1-2013海洋監(jiān)測技術(shù)規(guī)程》和《GB/T21925-2008水中除草劑殘留測定液相色譜/質(zhì)譜法》，涉及的方法僅限于氣相色譜質(zhì)譜法和液相色譜質(zhì)譜法的外標(biāo)定量，方法操作復(fù)雜、靈敏度和準(zhǔn)確度都較低，檢出限為5-250ng/L，極大影響了海洋環(huán)境監(jiān)管和水產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易的順利開展。因此，迫切需要建立海水中三嗪類除草劑的高通量、高靈敏檢測標(biāo)準(zhǔn)。本項(xiàng)目將建立準(zhǔn)確、高效并易于普及的海水中三嗪類除草劑測定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。新制定標(biāo)準(zhǔn)將做以下制定：共檢測西瑪津（Simazine）、西草凈（Simetryne）、莠去津（Atrazine）、莠滅凈（Ametryn）、特丁津（Terbuthylazine）、撲草凈（Prometryn）以及特丁凈（Terbutryn）等7種三嗪類除草劑。通過優(yōu)化樣品前處理方法和質(zhì)譜儀器方法，采用內(nèi)標(biāo)法定量，所有組分檢出限不高于5.0ng/L。不僅可以為我國海洋環(huán)境保護(hù)和監(jiān)管事業(yè)提供技術(shù)支持，更能進(jìn)一步了解我國海洋中的污染現(xiàn)狀，保障國家海洋環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)穩(wěn)定，確保我國水產(chǎn)品質(zhì)量安全和進(jìn)出口貿(mào)易的順利開展，對樹立我國海洋環(huán)境和食品安全形象至關(guān)重要。在該項(xiàng)目的支持下，我們已經(jīng)完成了海水中三嗪類除草劑液質(zhì)聯(lián)用檢測方法的開發(fā)工作。三、地方標(biāo)準(zhǔn)編制原則、主要技術(shù)內(nèi)容和確定依據(jù)（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則本標(biāo)準(zhǔn)制定的主要原則，一是標(biāo)準(zhǔn)具有適用性，適用于海洋中三嗪類除草劑的污染監(jiān)測，為評估海洋污染提供技術(shù)基礎(chǔ)；二是標(biāo)準(zhǔn)具有科學(xué)性和可操作性，能夠確保海洋環(huán)境保護(hù)和監(jiān)管工作的準(zhǔn)確性；三是標(biāo)準(zhǔn)具有先進(jìn)性，與先進(jìn)國家的標(biāo)準(zhǔn)相接軌，確保標(biāo)準(zhǔn)的先進(jìn)性；四是標(biāo)準(zhǔn)具有規(guī)范性，本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草，符合標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)、起草原則和表述規(guī)則、編排格式。（二）標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容和確定依據(jù)1.標(biāo)準(zhǔn)適用范圍的確定山東省是農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖大省，撲草凈、西瑪津、莠去津、特丁津、莠滅凈和特丁凈等是世界農(nóng)化網(wǎng)中文網(wǎng)報道在我國使用最多的三嗪類農(nóng)用除草劑，撲草凈在國內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖中可作為水質(zhì)改良劑用于水體中有害藻類的清除，其在海參和貝類中檢出率較高。因此，最終確定莠去津、撲草凈、西草凈、西瑪津、莠滅凈、特丁凈和特丁津等7種三嗪類除草劑作為主要的監(jiān)控對象。通過提取溶劑、提取方式、鹽度影響、定量方式比較，在滿足精密度、準(zhǔn)確度和靈敏度的基礎(chǔ)上，確定本文件適用于海水中莠去津、撲草凈、西草凈、西瑪津、莠滅凈、特丁凈和特丁津等三嗪類除草劑的測定。2．方法原理的確定根據(jù)目標(biāo)物的極性，通過優(yōu)化提取方式和提取溶劑，確定二氯甲烷液液萃取的提取方案，并通過內(nèi)標(biāo)定量校正法確定7種化合物均具有合適的回收率。確定方法原理：海水樣品中的三嗪類除草劑，在堿性條件下用二氯甲烷萃取，萃取液經(jīng)凈化濃縮后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，內(nèi)標(biāo)法定量。3．方法主要參數(shù)及實(shí)驗(yàn)條件的確定3.1色譜條件的確定色譜條件的選擇是方法建立的關(guān)鍵，可優(yōu)化的條件有色譜柱的類型、柱長、內(nèi)徑、粒徑以及流動相的配比和流速等參數(shù)。三嗪類除草劑具有較好的親水性，采用傳統(tǒng)C18反相色譜柱即可實(shí)現(xiàn)這類化合物的良好分離。本實(shí)驗(yàn)通過對比最終確定采用KinetexXBC18色譜柱(4μm，2.1mm×100mm)，以0.1%甲酸溶液（A）和乙腈（B）為流動相進(jìn)行梯度淋洗，梯度洗脫程序見表1，7種目標(biāo)物及3種內(nèi)標(biāo)在10min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)良好分離，提取離子色譜圖見圖2。表1流動相梯度洗脫程序 時間（min） A（%）B（%）0.09553.09553.15956.35956.59558.0955圖27種除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的特征離子質(zhì)量色譜圖3.2質(zhì)譜條件的確定根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)采用串聯(lián)質(zhì)譜的MRM掃描進(jìn)行準(zhǔn)確定量，用針泵以20μL/min的流速注入1mg/L的三嗪類除草劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，電離時會同時產(chǎn)生正負(fù)離子，實(shí)驗(yàn)表明,正離子[M+H]+采集到的信號較強(qiáng)，因此方法最終確定以正離子方式(ESI+)進(jìn)行采集。在m/z100~300掃描范圍內(nèi)以正離子模式進(jìn)行一級質(zhì)譜圖掃描，確定目標(biāo)物的分子離子。然后分別進(jìn)行子離子掃描,選取豐度最強(qiáng)且干擾較少的作為各自的定量離子，以次強(qiáng)離子作為定性離子。參照歐盟2002/657/EC決議要求，質(zhì)譜定性需要4個確證點(diǎn)(Identificationpoint，IP)，三重四級桿質(zhì)譜的母離子IP為1.0，子離子IP為1.5，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇一個母離子，同時選擇兩個二級子離子，總確證點(diǎn)即可達(dá)到4.0，從而實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜的定性確證。最后以多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)正離子模式優(yōu)化碰撞能量(Collisionenergy)等質(zhì)譜參數(shù)，使各種化合物在適合的質(zhì)譜條件下分析，提高目標(biāo)物的儀器響應(yīng)，從而提高各化合物的靈敏度。最終確定的離子對信息和碰撞能量見表2。表27種三嗪類除草劑的質(zhì)譜參數(shù)化合物Compounds內(nèi)標(biāo)Internalstandard母離子Parention(m/z)子離子Productions(m/z)碰撞能量Collisionenergy(ev)莠去津（Atrazine）莠去津-D5216.1174*,13218,23撲草浄（Prometryn）撲草凈-D6242.0200*,15817,25西草凈（Simetryne）撲草凈-D6214.0124*,9617,20西瑪津（Simazine）莠去津-D5202.0132*,12420,20莠滅凈（Ametryn）撲草凈-D6228.1186*,9618,36特丁凈（Terbutryn）撲草凈-D6242.1186*,15820,25特丁津（Terbuthylazine）特丁津-D5230.0174*,13216,23撲草凈-D6/248.0206*17莠去津-D5/221.0179*20特丁津-D5/235.0179*16注：*為定量碎片離子3.3樣品前處理方法的確定（1）分別采用固相萃取和液液萃取對海水加標(biāo)樣品進(jìn)行前處理，HLB固相萃取和二氯甲烷液液萃取測得的三嗪類除草劑回收率均較高。然而，上樣500mL海水采用固相萃取方法效率太低，耗費(fèi)人力或需要輔助海水上樣裝置；且實(shí)際海水樣品雜質(zhì)干擾復(fù)雜，500mL上樣量超出普通固相萃取柱的負(fù)載量。綜合以上考慮，最終選擇液液萃取方式，對大體積海水樣品中除草劑進(jìn)行處理，對于特丁津等回收率較低現(xiàn)象采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行校正。圖3二氯甲烷和乙酸乙酯液液萃取對三嗪類除草劑回收率的比較（2）本實(shí)驗(yàn)在液液萃取過程中，分別比較了二氯甲烷和乙酸乙酯兩種有機(jī)溶液對目標(biāo)物的萃取效果（圖3），通過比較發(fā)現(xiàn)二氯甲烷的整體效果優(yōu)于乙酸乙酯，因此確定采用二氯甲烷作為萃取溶劑。（3）另外，在最優(yōu)化條件下，針對不同鹽度水體基質(zhì)樣品方法的適用性問題，分別優(yōu)化了鹽度為（0、10、20、30、40‰）的水體基質(zhì)中添加三嗪類除草劑（50ng/L）的回收率影響（圖4）。發(fā)現(xiàn)鹽度為0‰的淡水基質(zhì)中回收率偏高，在110%~150%之間，其中淡水基質(zhì)中內(nèi)標(biāo)含量明顯低于其他組，推測內(nèi)標(biāo)物質(zhì)在淡水中的溶解度較大，降低了其在最終定溶液中的濃度，導(dǎo)致回收率偏高。增大水的鹽度，可降低內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的水溶性，提高萃取量，從而將回收率調(diào)整到合適范圍。在其他鹽度下，7種三嗪類除草劑的回收率差別較小，均在70%~120%之間，說明本方法更適用于一定鹽度水體中三嗪類除草劑的測定，后期對于淡水基質(zhì)考慮前處理中增加鹽度來優(yōu)化其回收率。因此，確定鹽度對方法的回收率有一定影響，對于海水基質(zhì)回收率較好，不需要優(yōu)化鹽度。圖4不同鹽度下三嗪類除草劑回收率比較基于以上實(shí)驗(yàn)，確定的最優(yōu)化前處理方法：準(zhǔn)確量取500mL過濾后的海水試樣，倒入1L分液漏斗中，準(zhǔn)確加入50μL混合內(nèi)標(biāo)工作液（5.11），振蕩混勻，用氨水（5.3）調(diào)節(jié)pH至9左右；加入40mL二氯甲烷（5.4），振蕩10min，靜置分層，收集萃取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中；繼續(xù)用30mL和20mL二氯甲烷分兩次萃取水樣，合并萃取液至上述旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，濃縮至約1mL，40℃氮?dú)獯抵两?；?.1%甲酸-乙腈溶液（5.6）1mL溶解殘留物，經(jīng)有機(jī)相濾膜（6.7）過濾至進(jìn)樣瓶中，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。3.4定量方法的確定參考標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)報道，三嗪類除草劑的定性定量測定主要通過標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法。然而，外標(biāo)法回收率難以保證，準(zhǔn)確度不高。本標(biāo)準(zhǔn)引進(jìn)內(nèi)標(biāo)，通過多個內(nèi)標(biāo)校正定量，并結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)校正方法對三嗪類除草劑的回收率比較見圖5，發(fā)現(xiàn)內(nèi)標(biāo)法定量對7種目標(biāo)組分的回收率普遍高于外標(biāo)法，因此，確定采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。內(nèi)標(biāo)物選擇需要與對應(yīng)目標(biāo)物的響應(yīng)相當(dāng)，同時消除操作過程對分析結(jié)果的影響，保證目標(biāo)物的回收率結(jié)果在70%~120%。試驗(yàn)過程中出于成本和操作需要，針對多個目標(biāo)物在滿足回收率條件下，盡量減少內(nèi)標(biāo)物的數(shù)量。一般對應(yīng)目標(biāo)物的氘代物質(zhì)最適合作為其內(nèi)標(biāo)物，而從結(jié)構(gòu)相似性角度，結(jié)構(gòu)中同樣具有Cl取代基的西瑪津、特丁津和莠去津以莠去津-D5作為內(nèi)標(biāo)最為合適，同樣具有CH3S取代基的西草凈、莠滅凈、特丁凈和撲草凈以撲草凈-D6為內(nèi)標(biāo)最為合適。在優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)用撲草凈-D6和莠去津-D5作為內(nèi)標(biāo)校正特丁津時，回收率皆低于50%，不適合作其內(nèi)標(biāo)，而選擇特丁津-D5做其內(nèi)標(biāo)可以將回收率做到70%以上。通過試驗(yàn)篩選，為滿足回收率條件確定選擇三種內(nèi)標(biāo)物（撲草凈-D6、莠去津-D5和特丁津-D5）。圖5海水中三嗪類除草劑采取不同定量方法的回收率比較3.5標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性確定本方法采用甲醇溶解，并分別對100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液和1.0μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液進(jìn)行穩(wěn)定性測試。分別制備兩份對照溶液，分別儲存于-20℃和-4℃以下避光保存。在不同監(jiān)測時間點(diǎn)采用當(dāng)天配置的標(biāo)準(zhǔn)溶液，校對每份對照溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量變化，具體監(jiān)測結(jié)果見下表：表4混合標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取用標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度測試時間點(diǎn)實(shí)際測定濃度西瑪津西草凈莠去津莠滅凈特丁津撲草凈特丁凈100μg/mL0天101±0.2698.0±0.5298.0±0.5299.5±0.7299.5±0.72100±0.3398.0±0.527天99.7±0.58102±0.37102±0.3799.6±0.5799.6±0.5799.6±0.16102±0.3714天99.5±1.2597.6±1.5797.6±1.5798.6±1.2698.6±1.2698.6±1.0697.6±1.571個月100±2.3597.8±1.0698.1±1.0698.4±0.3597.8±0.3599.0±2.5697.8±1.066個月99.7±1.5697.6±2.4697.6±2.1197.9±3.5997.4±3.5998.7±1.5898.1±2.9612個月96.7±1.5893.4±1.4493.4±1.4490.5±2.6890.5±2.6893.4±4.2693.4±1.441.0μg/mL0天10.0±0.169.97±0.919.97±0.919.94±0.369.94±0.369.94±0.849.97±0.9114天9.49±0.439.88±0.529.88±0.529.79±0.269.79±0.269.86±0.269.88±0.521個月9.44±0.229.86±0.699.86±0.699.57±0.209.57±0.209.87±0.319.86±0.692個月9.06±0.249.59±0.669.59±0.669.08±0.349.08±0.349.49±0.389.59±0.663個月9.06±0.249.59±0.669.59±0.669.08±0.349.08±0.349.49±0.389.59±0.66表5混合內(nèi)標(biāo)溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取用標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度測試時間點(diǎn)實(shí)際測定濃度撲草凈-D6莠去津-D5特丁津-D5100ug/mL0天99.6±1.78103±0.7798.8±1.517天99.4±0.93100±1.3999.3±1.4414天99.7±1.2699.6±1.2299.1±1.321個月101±2.0398.8±1.4798.4±2.196個月99.3±1.8899.0±2.0798.7±1.9812個月95.6±2.1493.8±2.7994.2±1.371.0μg/mL0天9.68±0.259.93±0.699.89±0.6414天9.72±0.889.95±0.529.90±0.731個月9.74±0.469.83±0.379.87±0.492個月9.55±0.399.54±0.699.46±0.653個月9.43±0.589.38±0.579.37±0.47依據(jù)上述數(shù)據(jù)，為了保證結(jié)果的穩(wěn)定性，確定標(biāo)準(zhǔn)溶液的保質(zhì)期分別為100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液6個月有效期和1.0μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液1個月有效期。3.6樣品測定在同樣測試條件下，試樣液中待測物的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)工作液中待測物的保留時間偏差在±2.5%以內(nèi)，在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，所選擇的特征離子均應(yīng)出現(xiàn)，且檢測到的離子的相對豐度，應(yīng)與濃度相當(dāng)?shù)男Ｕ龢?biāo)準(zhǔn)溶液相對豐度一致。其允許偏差應(yīng)符合表6要求。表6試樣相對離子豐度與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度/（%）允許偏差/（%）＞50±20＞20～50±25＞10～20±30≤10±50試樣中三嗪類除草劑的含量按下式計(jì)算：公式中：X——試樣中被測組分三嗪類除草劑的含量，單位為納克每升（ng/L）；Ci——試樣溶液中對應(yīng)的被測組分濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V1——試樣溶液定容體積，單位為毫升（mL）；V2——供試試樣的體積，單位為升（L）。3.7方法檢出限、定量限及線性范圍的確定用甲醇配置系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時含有混合標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)和內(nèi)標(biāo)的溶液，每個溶液中內(nèi)標(biāo)濃度相同，外標(biāo)濃度成梯度濃度分別為1.00μg/L、5.00μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100μg/L。通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確定量，以目標(biāo)物定量離子與內(nèi)標(biāo)物定量離子峰面積比為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)(R2)。方法線性范圍：1.00ng/mL～100ng/mL，此方法線性范圍廣，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，線性關(guān)系良好，適用于海水中三嗪類除草劑的定量分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6~12。在空白海水中添加三嗪類除草劑混合濃度為5ng/L時，峰形明顯，信噪比（S/N）均大于3，因此確定方法的檢出限為5ng/L。方法定量限是在特定的分析步驟條件下能夠準(zhǔn)確定量測定的待測物質(zhì)最小濃度，本方法在添加三嗪類除草劑濃度為10ng/L時，信噪比均大于10，回收率均大于70%，因此最終確定該方法的定量限為10ng/L。圖6西草凈標(biāo)準(zhǔn)曲線圖7西瑪津標(biāo)準(zhǔn)曲線圖8莠去津標(biāo)準(zhǔn)曲線圖9特丁津標(biāo)準(zhǔn)曲線圖10莠滅凈標(biāo)準(zhǔn)曲線圖11撲草凈標(biāo)準(zhǔn)曲線圖12特丁凈標(biāo)準(zhǔn)曲線3.8方法準(zhǔn)確度和精密度確定方法驗(yàn)證參照歐盟的實(shí)施準(zhǔn)則和對農(nóng)藥殘留分析的驗(yàn)證程序，在線性范圍內(nèi)通過向空白海水樣品中同時添加7種三嗪類除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，參照確定的處理方法和儀器參數(shù)得到回收率和精密度。我們以空白海水為測試對象，添加濃度按照定量限、5倍定量限、10倍定量限，進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，以確定方法的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7，不同濃度的加標(biāo)量下，樣品的回收率都在70%～120%之間，批內(nèi)和批間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在15%以下。圖13-16顯示為空白海水和三個不同濃度加標(biāo)海水樣品的特征離子質(zhì)量色譜圖。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，該方法的準(zhǔn)確度和精密度可以滿足藥殘檢測的要求，且方法操作穩(wěn)定，重復(fù)性好。表7海水中三嗪類除草劑類的添加回收率及精密度分析物添加量ng/L測定批次測定值ng/L平均回收率%,n=6批內(nèi)RSD,%批間RSD,%西瑪津10111.0611.0810.5611.3711.2511.44109.64.257.20211.0810.5711.3511.6810.3811.76111.45.12310.3510.569.1439.26511.8610.32102.59.6650154.4354.2659.7854.3854.6859.49112.34.794.45252.5854.8654.6555.7654.1351.55107.82.90353.8752.8253.0059.0555.9758.54111.14.971001108.2106.3103.9106.7107.1104.0105.61.644.422107.4104.5102.599.75102.4107.3103.32.903100.793.0596.5395.7597.42101.596.903.25西草凈1019.3159.67611.079.5389.17710.1498.207.1010.129.64210.3211.9712.869.35310.75108.212.639.65310.389.63610.359.63811.85102.58.3950145.0151.1854.4740.245.8950.5295.8010.87.18249.6451.9650.6449.6346.8548.6499.103.51353.3348.6553.7348.6752.2746.53101.15.88100193.0593.7986.7786.0388.4887.8588.603.685.87299.7396.8682.8798.9488.6492.4692.007.07392.5695.6383.9796.5894.7583.7590.906.41莠去津10111.8111.6711.6811.0611.6111.23115.12.564.94211.1210.1311.2510.9310.3711.54108.94.95310.4510.7510.8310.1611.7511.18108.55.1650153.1554.1154.7258.0153.4860.268252.5455.6253.4853.2760.9260.53112.16.70351.6652.3260.2350.2152.4652.45106.46.651001103.494.6094.49111.397.0789.0097.308.036.792103.892.3490.35110.292.4593.2195.708.26399.62101.9103.2104.9106.498.46103.02.97莠滅凈10110.2110.2510.7410.6911.2311.70108.05.345.64211.3111.1210.2511.1610.3511.09108.84.20311.3511.4311.9712.4911.2311.65116.94.0450144.2752.6251.4649.5459.1857.58104.910.47.96250.1453.5452.3754.2151.8751.98104.72.72349.7342.8750.1451.3249.8445.6396.506.78100194.5995.3097.79107.1104.496.435297.2499.45101.3106.3100.2101.4101.72.99393.57101.3103.897.5793.7795.6398.404.27特丁津10110.0510.4910.789.97710.1310.61210.3810.8610.7810.769.64210.78105.34.4539.4739.85711.9711.3511.6311.27109.39.2850148.648.1859.0948.0648.0457.731248.5349.5258.5349.0752.6349.88102.77.38350.5660.2359.6553.6250.7550.73108.58.39100198.5696.3896.2794.396.4293.6295.401.833.79297.4396.4399.8799.8590.3894.9196.303.69395.3898.6389.7989.3789.4890.5291.604.21撲草凈10110.1411.4911.308.73910.1311.99106.311.212.0210.829.76412.979.7549.37210.47105.312.4310.839.65710.367.4159.8819.93796.8012.250152.0751.4759.5451.6350.5458.44107.97.339.08248.2642.9559.4249.6847.4850.3899.4010.9343.7552.8149.0550.2647.2350.5297.906.401001104.1104.8101.5103.0104.898.86102.62.264.88294.73100.4104.7102.494.6797.84100.04.14392.659