蛋白質(zhì)在細(xì)胞和生物體的生命活動(dòng)過程中

蛋白質(zhì)在細(xì)胞和生物體的生命活動(dòng)過程中蛋白質(zhì)在細(xì)胞和生物體的生命活動(dòng)過程中/蛋白質(zhì)在細(xì)胞和生物體的生命活動(dòng)過程中蛋白質(zhì)在細(xì)胞和生物體的生命活動(dòng)過程中，起著十分重要的作用。生物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都與蛋白質(zhì)有關(guān)。蛋白質(zhì)還參與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，以與細(xì)胞中氧化還原、電子傳遞、神經(jīng)傳遞乃至學(xué)習(xí)和記憶等多種生命活動(dòng)過程。在細(xì)胞和生物體內(nèi)各種生物化學(xué)反應(yīng)中起催化作用的酶主要也是蛋白質(zhì)。因此，蛋白質(zhì)也是生命科學(xué)中極為重要的研究對(duì)象。我們針對(duì)近年來有關(guān)蛋白質(zhì)的分離純化技術(shù)所取得的進(jìn)展進(jìn)行了綜述，為今后的理論和應(yīng)用研究提供依據(jù)。1蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)1．1根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離技術(shù)1．1．1離子交換層析以離子交換劑作為柱填充物，在中性條件下，根據(jù)由于蛋白質(zhì)和多肽的帶電性不同而引起的離子交換親和力的不同而得到分離。其可分為陽離子柱和陰離子柱兩大類，還有一些新型樹脂，如大孔型樹脂、均孔型樹脂、離子交換纖維素、葡聚糖凝膠瓊脂糖凝膠樹脂等。Wu等[[]WuD，Waltersprefectsofstationaryphaseliganddensityonhighperformanceiron-exchangechromatographyofprotein[J]．JChromatogr，1992．]利用IEXC法，探討分離牛碳酸酐酶異構(gòu)體和牛血清白蛋白、雞血清白蛋白酶的提取條件，獲得了有價(jià)值的數(shù)據(jù)。趙榮樂等[[]趙榮樂，鄭光字．離子交換層析和凝膠過濾分離純化抗凝血多肽[J]．北京師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，8(4)：544-548．][]WuD，Waltersprefectsofstationaryphaseliganddensityonhighperformanceiron-exchangechromatographyofprotein[J]．JChromatogr，1992．[]趙榮樂，鄭光字．離子交換層析和凝膠過濾分離純化抗凝血多肽[J]．北京師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，8(4)：544-548．1．1．2電泳法電泳為帶電粒子在電場中向與其自身所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象。蛋白質(zhì)混合樣品經(jīng)過電泳后，被分離的各蛋白質(zhì)組分的電泳遷移率互不相同，由各蛋白質(zhì)組分所帶的靜電荷以與分子大小和形狀的不同而達(dá)到分離。常用SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳，毛細(xì)管電泳在純化蛋白的方面也得到了很好的應(yīng)用[[]阮小林，謝天堯，莫金垣．毛細(xì)管電泳在蛋白質(zhì)等生物大分子分析中的應(yīng)用[J]．現(xiàn)代醫(yī)學(xué)儀器與應(yīng)用，2002，[]阮小林，謝天堯，莫金垣．毛細(xì)管電泳在蛋白質(zhì)等生物大分子分析中的應(yīng)用[J]．現(xiàn)代醫(yī)學(xué)儀器與應(yīng)用，2002，14(4)：l4-l8．[]翁瑜，曾群力，姜槐，等．雙向凝膠電泳比較三種常用蛋白質(zhì)提取方法[J]．中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2005，21(5)：69l-694．1．2根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離技術(shù)1．2．1蛋白質(zhì)的鹽析蛋白質(zhì)在低鹽濃度下的溶解度隨著鹽溶液濃度升高而增加，此稱鹽溶；當(dāng)鹽濃度不斷上升時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度又以不同程度下降并先后析出，此稱鹽析，從而達(dá)到分離純化的效果。一般粗抽提物常用該法進(jìn)行粗分。1．2．2有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，導(dǎo)致溶解度的降低；另有機(jī)溶劑與水的作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，故蛋白質(zhì)在一定濃度的有機(jī)溶劑中便沉淀析出。利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機(jī)溶劑中的溶解度差異而分離的方法即為有機(jī)溶劑沉淀法。常用于蛋白質(zhì)和酶的提純中。1．2．3等電點(diǎn)沉淀法利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低而各種蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)的特點(diǎn)進(jìn)行分離的方法。用于提取后去除雜蛋白，通過變動(dòng)提取液的pH使某些與待提純的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)相距較大的雜蛋白從溶液中沉出。但此法很少單獨(dú)使用，可與鹽析法結(jié)合使用。1．3根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的分離技術(shù)1．3．1超濾超濾法是利用壓力或離心力，使用一種特制的薄膜對(duì)溶液中各種溶質(zhì)分子進(jìn)行選擇性過濾，強(qiáng)行使水和其他小分子溶質(zhì)通過半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在膜上，以達(dá)到濃縮和脫鹽的目的。因此根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的不同，選擇不同規(guī)格的濾膜進(jìn)行超濾，從而使蛋白質(zhì)得到分離。樊晶等應(yīng)用萃取一超濾兩步法從過期人血中提取人血紅蛋白[[][]樊晶，陳連旺．應(yīng)用萃取一超濾兩步法從過期人血中提純?nèi)搜t蛋白[J]．天津藥學(xué)，2002，14(1)：33-35．1．3．2凝膠層析混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)裝有凝膠作為固定相的層析柱時(shí)，混合物中各物質(zhì)因分子大小不同而被分離，在洗脫過程中，分子質(zhì)量最大的物質(zhì)因不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外，分子量最小的物質(zhì)因能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而受阻滯，流速緩慢，致使最后流出柱外。它是一種快速而簡便的分離分析技術(shù)，由于設(shè)備簡單，操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對(duì)高分子物質(zhì)有很高的分離效果，因此被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程以與醫(yī)藥學(xué)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[[]楊安鋼，毛積芳，藥立波，等．生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]．北京：高等教育出版社，2001：14-18]。王海英等[[]王海英，薛長湖，孫謐，等．大菱鲆腸道蛋白酶的分離純化及性質(zhì)的初步研究[J]．水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2005，10(5)：624-629．]，以大菱鲆腸道為材料，DEAE—SepharoseFastFlow[]楊安鋼，毛積芳，藥立波，等．生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]．北京：高等教育出版社，2001：14-18[]王海英，薛長湖，孫謐，等．大菱鲆腸道蛋白酶的分離純化及性質(zhì)的初步研究[J]．水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2005，10(5)：624-629．[]董轉(zhuǎn)年，龔秀會(huì)，彭波，等．天麻多肽的分離純化研究[J]．生物技術(shù)，2007，12(6)：56-58．1．4根據(jù)配體特異性的分離技術(shù)——親和層析利用生物大分子與某些相對(duì)應(yīng)的專一分子特異識(shí)別和可逆結(jié)合的特性而建立起來的一種分離生物大分子的色譜方法。只需要一步處理即可使某種待分離的蛋白質(zhì)從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來，達(dá)到千倍以上的純化，并保持較高的活性。目前親和層析技術(shù)被廣泛地應(yīng)用在蛋白質(zhì)研究和制備領(lǐng)域，是分離純化以與分析生物大分子尤其是蛋白質(zhì)的有力工具。利用該法從粗提液中經(jīng)過一次簡單的處理便可得到所需的高濃度活性物質(zhì)[[]韓金玉，那平，元英進(jìn)．親和色譜純化蛋白質(zhì)新進(jìn)展[J]．色譜1996，14(6)：447-450．]。Reddy[]韓金玉，那平，元英進(jìn)．親和色譜純化蛋白質(zhì)新進(jìn)展[J]．色譜1996，14(6)：447-450．[]ReddyLG，JonesLR，PaceRC，et1a．Purified，reconstitutedcardiacCa2+ATPaseisregulatedbyphospholambanbutnotbydirectphosphorylationwithCa2+／Clamodulin2dependentproteinkinase[J]．Thejournalofbiologicalchemistry，1996，271(25)：14964-14970．1．5根據(jù)選擇性吸附的分離技術(shù)1．5．1羥磷灰石層析吸附劑羥磷灰石可用于分離蛋白質(zhì)和核酸。蛋白質(zhì)中帶負(fù)電基團(tuán)與羥磷灰石晶體表面的鈣離子結(jié)合，而帶正電基團(tuán)與磷酸基相互作用，羥磷灰石對(duì)蛋白質(zhì)的吸附容量比較大。因此，根據(jù)蛋白質(zhì)分子與吸附劑羥磷灰石之問的吸附能力和解吸性質(zhì)的不同而達(dá)到分離的目的。1．5．2疏水作用層析根據(jù)蛋白質(zhì)表面的疏水性差別發(fā)展起來的一種純化技術(shù)。其中，連接在支持介質(zhì)上的疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)表面上暴露的疏水基團(tuán)結(jié)合。但是疏水層析的某些洗脫條件可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性，而且還存在不可預(yù)測性，對(duì)某些蛋白質(zhì)分離效果很好，對(duì)另一些則不好。因此，近年來發(fā)展的新方法，常用硫酸銨沉淀、離子交換和親和層析之后，進(jìn)行疏水層析的樣品不需要透析、凝膠過濾等方式脫鹽。1．6高效液相色譜層析(HPLC)HPLC是一個(gè)高效快速分離化合物的方法，由于其分辨率高，速度快，重復(fù)性好，適用面廣，靈活性強(qiáng)，靈敏度高等特點(diǎn)，使它在近年生物大分子的分離和純化方面占據(jù)了極其重要的地位。因此，它能有效地分離各種多肽混合物，特別適用于分子質(zhì)量不大的蛋白質(zhì)和多肽物質(zhì)的分離、純化和鑒定，在蛋白質(zhì)與多肽研究中已得到了廣泛的應(yīng)用。其中反相高效液相色譜(RPLC)被廣泛應(yīng)用于分子質(zhì)量不大的蛋白質(zhì)分離、純化和鑒定上，所使用的RPLC約95％是C18反相硅膠HPLC[[]朱曉囡，蘇志國．反相液相色譜在蛋白質(zhì)及多肽分離分析中的應(yīng)用[J]．分析化學(xué)評(píng)述與進(jìn)展，2004，2(32)：248-254．]。Haught等[[]HaughtC，DavisGD，SubramanianR,etal．Recombinantproducationandpurifcationofnovelantisenseantiimerobilapeptidein[]朱曉囡，蘇志國．反相液相色譜在蛋白質(zhì)及多肽分離分析中的應(yīng)用[J]．分析化學(xué)評(píng)述與進(jìn)展，2004，2(32)：248-254．[]HaughtC，DavisGD，SubramanianR,etal．RecombinantproducationandpurifcationofnovelantisenseantiimerobilapeptideinEscherichiacoli[J]．Biotechno1．Bioeng，1998，57(1)：55-61．[]NakagomiK，F(xiàn)ujimuraA，EbisuH，etal．Aeein-1,anovelaligotensin—I—conveitingenzymeinhibitorypepifdeisolatedfromtryptichydorlysateofhumnaplsma[J]．FEBSLett，1998，438(3)：255-257．[]BonetoV，KangurL，PalumaaP，etaI．ScaleHPlCpurifiestionofcalbindinD9Kfromporcineintestine[J]．ProteinExpr．PuriL，1999，17(3)：387-391．[]LiYiming，WuGong，ZhnagNaixia．Purificationofneuropeptidesusinggradientreversed-phasehigh-pedormanceliquidchromatographywithnoveldetectionmethod-ologies[J]．ActsBiochimicaetBiophysicaSiniea，2000，32(4)：351-355．1．7大孔吸附樹脂法一類薪型非離子型具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子化合物，具有吸附和篩選性能，容易再生，所以在分離純化蛋白質(zhì)時(shí)具有條件溫和，設(shè)備簡單和操作方便的特點(diǎn)[[][]趙利，