《基因表達(dá)》(研究生)全冊(cè)配套完整課件

《基因表達(dá)》(研究生)全冊(cè)配套完整課件《基因表達(dá)》

GENESEXPRESSION基因表達(dá)導(dǎo)論學(xué)生眼中的《基因表達(dá)》老師眼中的《基因表達(dá)》科學(xué)方法學(xué)中的《基因表達(dá)》分子生物學(xué)中的《基因表達(dá)》應(yīng)用意義上的《基因表達(dá)》發(fā)展中的《基因表達(dá)》認(rèn)知論上的基因表達(dá)文字的作用心理的作用自身的感知極限表達(dá)的相對(duì)性與事實(shí)的客觀性主要參考書目書名編者出版社出版時(shí)間分子遺傳學(xué)盛祖嘉等復(fù)旦大學(xué)出版社1988年基因VIII本杰明·盧因科學(xué)出版社(余龍)2005年genesIXBenjaminLewin2007基因的分子生物學(xué)Watson科學(xué)出版社(楊煥明)2005/2009考試平時(shí)成績(jī)(20分)：2次課堂練習(xí)，每次1~2題，提前1周通知；期末考試(80分)

閉卷(40分)：10個(gè)名詞解釋，4個(gè)小問答。(時(shí)間40分鐘，交卷后再進(jìn)行開卷考試)；

開卷(40分)：4個(gè)論述題。

(時(shí)間75分鐘，不準(zhǔn)相互交流和攜帶筆記本)。第一章概述基因和基因表達(dá)基因（概念）的發(fā)展基因表達(dá)RNA也能提供遺傳信息遺傳學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史年份概念演進(jìn)1865基因是某種特定因子1871發(fā)現(xiàn)核酸1903染色體是遺傳單位1910基因位于染色體上1913基因在染色體上是線性排列的1927突變是基因上物理變化1931交換導(dǎo)致重組1944DNA是遺傳物質(zhì)1945一個(gè)基因編碼一個(gè)蛋白1951蛋白質(zhì)首次測(cè)序1953DNA是雙螺旋結(jié)構(gòu)1958DNA是半保留復(fù)制1961發(fā)現(xiàn)三聯(lián)體遺傳密碼1977真核基因是不連續(xù)的1977DNA可以測(cè)序1995基因組首次測(cè)序1.1基因是DNA

GenesareDNADNA作為生物體獨(dú)有的一種語言，是靠非常簡(jiǎn)單的A、T、C和G四種堿基來完成的生命體通過這門語言對(duì)內(nèi)從時(shí)空上調(diào)控其生命活動(dòng)，維持內(nèi)環(huán)境的平衡和穩(wěn)定；對(duì)外則對(duì)各種各樣的外來刺激作出反應(yīng)，保持一定限度范圍內(nèi)的適應(yīng)性1.2基因表達(dá)DNA分子的堿基序列中隱藏了生物體中所有的遺傳信息?；虮磉_(dá)就是將這些信息通過特定的傳遞鏈顯現(xiàn)出來的過程基因表達(dá)的宏觀主線是以中心法則提出及其后來的修正來體現(xiàn)中心法則的提出中心法則的修正完善基因表達(dá)與功能基因組目前克隆一個(gè)（真核）基因已經(jīng)是比較容易的事情，想明確該基因的部分功能也不是很難功能基因組面臨的困難之一在于如何弄清基因執(zhí)行其功能的過程中是怎樣受到各種各樣的內(nèi)因素作用，也就是說基因在表達(dá)的過程中如何受到內(nèi)環(huán)境調(diào)控的真核基因表達(dá)調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)清晰明了之后，我們才算真正地掌握了它的“來龍去脈”真核基因結(jié)構(gòu)一般真核基因的結(jié)構(gòu)包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)和基因表達(dá)區(qū)兩部分。轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)有增強(qiáng)子、沉默子、啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄啟始點(diǎn)之后為基因表達(dá)區(qū)原核生物的操縱子也有類似功能區(qū)域的劃分1.3RNA作為遺傳物質(zhì)逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組是單鏈的RNA分子感染周期中以單鏈RNA為模板，并由逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為單鏈DNA，進(jìn)而合成雙鏈DNA分子。隨后的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄便以這雙鏈DNA為中間模板，這種雙鏈DNA已成為基因組的一部分，就象基因一樣可以遺傳RNA的復(fù)制及逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象的存在，說明了遺傳信息可以以核酸的任何一種形式存在，且這兩種形式之間可互相轉(zhuǎn)換RNA擬酶RNA擬酶（ribozyme：也叫核糖擬酶、核酶）的發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)重要意義：1.使人們認(rèn)識(shí)到RNA也可以象蛋白質(zhì)一樣，具有酶學(xué)催化活性，可應(yīng)用于生化研究和基因工程研究2.為生命起源和分子進(jìn)化提供了新穎有力的證據(jù)。RNA可能是生命起源中最初出現(xiàn)的生命大分子，早期的自我復(fù)制系統(tǒng)可能就是由RNA一身兼任的1.4基因和基因組原核基因多數(shù)功能相關(guān)的基因串連一起，組成以操縱元（operon）為單位的調(diào)控單元，共同開啟或關(guān)閉，轉(zhuǎn)錄出多順反子(polycistron)的mRNA原核生物的基因?yàn)榈鞍踪|(zhì)編碼的序列絕大多數(shù)是連續(xù)的原核基因組原核生物的染色體較小基本上是單倍體原核基因組中除rRNA、tRNA基因有多個(gè)拷貝外，重復(fù)序列不多真核基因由一個(gè)結(jié)構(gòu)基因與相關(guān)的調(diào)控區(qū)組成，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子是斷裂基因（splitgene），基因間存在非編碼的間隔DNA（spacerDNA）功能相關(guān)的基因構(gòu)成各種基因家族，可以串聯(lián)在一起，也可以相距很遠(yuǎn)真核基因組結(jié)構(gòu)龐大人3×109bp；細(xì)胞存在染色質(zhì)、染色體、核膜等結(jié)構(gòu)一般含兩份同源的基因組具有多復(fù)制起點(diǎn)，每個(gè)復(fù)制子大小不一含有大量重復(fù)序列非編碼序列（non-codingsequence）占90%以上端粒（telomere）其他的序列原核與真核基因表達(dá)的差異

原核真核轉(zhuǎn)錄本多順反子單順反子mRNA來源不需加工必須經(jīng)過加工翻譯轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄和翻譯是在不同時(shí)間和空間進(jìn)行第二章 原核轉(zhuǎn)錄

Transcription

InProkaryotesDNARNAPROTEINtoday’sfocus單鏈書寫：5’→3’正鏈（＋）：非模板鏈負(fù)鏈（－）：模板鏈有義鏈（sensestrand

）：反義鏈（antisensestrand

）：2.1轉(zhuǎn)錄（Transcription）通過RNA多聚酶的催化作用從雙鏈DNA合成單鏈RNA，合成的方向是5’

3’，合成的序列信息與有義鏈一致RNA合成的模板是反義鏈RNA合成的必需組分：?jiǎn)?dòng)子（promotor），RNA多聚酶（RNApolymerase），NTPs,終止子（terminator）轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的第一步，也是最關(guān)鍵的一步轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的主要差異僅一條DNA模板鏈被轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶不需要引物，能從頭起始轉(zhuǎn)錄一個(gè)細(xì)胞的完整遺傳信息中僅有少部分被轉(zhuǎn)錄成RNA轉(zhuǎn)錄遠(yuǎn)沒有DNA復(fù)制精確2.2轉(zhuǎn)錄的基本過程

Basicprinciplesoftranscription起始（Initiation):RNA聚合酶和啟動(dòng)子延伸（Elongation):RNA聚合酶終止（Termination):終止子（terminator）起始InitiationRNA聚合酶與雙鏈DNA（dsDNA）結(jié)合滑動(dòng)直到發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子DNA螺旋解旋（unwind）在起始點(diǎn)（initiationsite，+1）開始合成RNAPromoter+1延伸ElongationRNA聚合酶一邊沿DNA移動(dòng)，一邊合成RNA鏈。聚合酶前的DNA不停解旋而聚合酶后面DNA重新螺旋（rewind）在3’-端加上核苷酸（ribonucleotides）RNA鏈的生長(zhǎng)方向是5’

3’聚合酶沿反義鏈上的移動(dòng)方向3’

5’終止TerminationRNA聚合酶識(shí)別終止子，停止合成。終止子通常是發(fā)夾（hairpin）結(jié)構(gòu)，有些終止子的需要輔助因子rho（ρ）轉(zhuǎn)錄復(fù)合物從DNA模板鏈上釋放RNA鏈釋放轉(zhuǎn)錄的起始延伸和終止Promoterbinding

DNAunwinding

RNAchaininitiation

RNAchainelongation

RNAchaintermination

Rho-dependenttermination

1.聚合不需要引物（primer）2.酶的活性依賴DNA，尤其是雙鏈DNA作為模板

3.RNA合成需要Mg2+，合成方向5’3’4.所有RNA聚合酶缺3’5’外切活性，每摻入約104~105個(gè)核苷酸就會(huì)發(fā)生一個(gè)錯(cuò)配5.物種之間存在差異(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi2.3RNA聚合酶RNApolymeraseRNA聚合酶與DNA聚合酶比較RNApolDNApol模板雙鏈DNA較好單/雙鏈DNA引物需求不是起始啟動(dòng)子復(fù)制點(diǎn)（origin）延伸40nt/sec900bp/sec終止子合成的RNA模板DNAE.coliRNA聚合酶僅由一種聚合酶完成全部RNA的轉(zhuǎn)錄

酶的組成：

2

’

全酶（Holoenzyme）=核心酶（Coreenzyme）+

全酶（

2

’

）:RNA合成的起始核心酶（2

’

）:RNA合成的延伸E.coliRNApolymeraseBothinitiation&elongationInitiationonly36.5KD36.5KD151KD155KD11KD70KD465kdsubunitSizeaaSize（d）genefunctionalpha(

)32936511rpoA酶組裝所需，與一些調(diào)節(jié)蛋白作用，也參與催化作用beta(β)1342150616rpoB催化作用：鏈的起始和延伸beta'(β')1407155159rpoC與DNA模板結(jié)合sigma(σ)61370263rpoD使酶定位到啟動(dòng)子上omega(ω)9110237rpoZ體外（invitro）恢復(fù)變性聚合酶的全部活性所必需的

亞基核心酶含有2個(gè)相同的組分由rpoA

基因編碼核心酶組裝所必需可能在啟動(dòng)子識(shí)別（promoterrecognition）中發(fā)揮作用

亞基由

rpoB

基因編碼是RNA聚合酶的催化中心利福平（Rifampicin）與β亞基結(jié)合，阻斷轉(zhuǎn)錄的起始。rpoB

基因的突變可以導(dǎo)致利福平抗性（resistance）利迪鏈菌素（Streptolydigins）抗性突變也定位在rpoB

基因，但抑制延伸而非起始β亞基可能包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域（domains

）分別對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)錄的起始和延伸

’亞基由rpoC基因編碼結(jié)合2個(gè)Zn2+

離子，可能參與酶的催化作用肝素（Heparin）與b’

亞基結(jié)合，在體外抑制轉(zhuǎn)錄肝素還與DNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合聚合酶b’

亞基負(fù)責(zé)與DNA模板鏈的結(jié)合

因子（

factor）許多原核生物擁有多個(gè)s

因子用來識(shí)別不同的啟動(dòng)子，E.coli最常用的是s70核心酶結(jié)合s

因子后轉(zhuǎn)變?yōu)槿竤

因子可以降低核心酶對(duì)DNA一般位點(diǎn)(non-specificDNAsites)的親和力(affinity)(10-4)，而增加對(duì)應(yīng)啟動(dòng)子的親和力來實(shí)現(xiàn)啟動(dòng)子識(shí)別轉(zhuǎn)錄起始后(RNA鏈有8~9nt)，s

因子從聚合酶中釋放出來和RNA聚合酶的其他亞基比，細(xì)胞中s

因子的數(shù)量較少E.coli

s70

的啟動(dòng)子序列有-10序列和

–35序列2.4轉(zhuǎn)錄單位

atranscriptionunit

ATACGTATGC+1promoterterminatorTranscribedregionRNADNATranscriptionAntisensestrandAUACG2.4.1啟動(dòng)子啟動(dòng)子序列在40bp到60bp之間-55to+20：是聚合酶結(jié)合區(qū)域-20to+20：聚合酶緊密結(jié)合區(qū)，保護(hù)其免受DNaseI的消化上游一直到-40的位置：?jiǎn)?dòng)子功能的重要區(qū)域-10序列和-35序列：對(duì)啟動(dòng)子來說尤其重要---5-8bp---GCTATTGACATATAAT-----16-18bp-------+1-35sequence-10sequence啟動(dòng)子序列-10序列（Pribonowbox）6bp序列以-10點(diǎn)為中心一致序列（consensussequence）為TATAAT開始的2個(gè)堿基（TA）和最后的T在E.coli啟動(dòng)子里高保守6聚體序列與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)+1的距離在5bp到8bp之間，這個(gè)距離重要-35序列保守的6聚體序列以-35點(diǎn)為中心一致序列為TTGACA開始的3個(gè)堿基（TTG）在E.coli啟動(dòng)子里高保守所有啟動(dòng)子里的90%，-35序列與-10序列的距離在16bp到18bp之間+1-7-12-31-365’mRNATTGACAAACTGT-35regionTATAATATATTA-10region79T44T96%T95A59A51APribnowbox84795345%82TTG64ACAconsensussequences全酶與啟動(dòng)子結(jié)合示意（over60bp）足跡法

DNaseIfootprintDNA序列單末端放射性標(biāo)記分組與RNA聚合酶結(jié)合DNaseI不完全消化消化產(chǎn)物變性，分離標(biāo)記的DNA片斷凝膠電泳，放射顯影DNaseIfootprint

用CRP和lac阻遏物分析lac啟動(dòng)子DNAa：Sequenceladderb：NoDNA-bindingproteinsaddedc：CRP（CAP）onlyd,e,f：CRP（CAP）andrepressorbothaddedg：RepressoronlyO是阻遏物結(jié)合區(qū)C是CRP結(jié)合區(qū)Science274,1930-1931（1997）轉(zhuǎn)錄起始——與啟動(dòng)子結(jié)合核心酶（

2

’

）和DNA的結(jié)合無特異性（松散結(jié)合）

因子增強(qiáng)核心酶與啟動(dòng)子結(jié)合的特異性聚合酶沿DNA滑動(dòng)尋找啟動(dòng)子的-35序列和-10序列，一旦發(fā)現(xiàn)即與之形成閉合復(fù)合體（closedcomplex）“閉合”意為DNA仍是雙螺旋形式，閉合二元復(fù)合物的形成是可逆的，平衡常數(shù)KB=106-109M-1轉(zhuǎn)錄起始——DNA解旋由聚合酶執(zhí)行的DNA解旋是必需的，這樣反義鏈才能參與堿基配對(duì)對(duì)于多數(shù)基因來說，負(fù)超螺旋能夠促進(jìn)解旋以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄，但有例外（e.g.gyrase）與酶結(jié)合的一小塊區(qū)域DNA被溶解后，轉(zhuǎn)化為開放復(fù)合體（opencomplex），導(dǎo)致這一系列反應(yīng)叫做緊密結(jié)合（tightbinding）對(duì)于強(qiáng)啟動(dòng)子，這個(gè)轉(zhuǎn)化是不可逆的，速率常數(shù)K2=10-3-10-1sec-1

轉(zhuǎn)錄起始——RNA鏈的起始無需引物，由GTP（多數(shù)情況）或ATP開始插入頭兩個(gè)核苷酸，在他們中間形成磷酸二酯鍵。產(chǎn)生RNA、DNA和酶的三元復(fù)合物，速度常數(shù)K1約10-3sec-1最初的9nt合并無須聚合酶沿DNA移動(dòng)和σ因子釋放。任何一個(gè)堿基加入，聚合酶都可能釋放RNA，導(dǎo)致流產(chǎn)起始（abortiveinitiations）產(chǎn)生流產(chǎn)起始后聚合酶又重新開始合成，RNA聚合酶往往需要經(jīng)歷多次的流產(chǎn)起始，產(chǎn)生一系列短的寡聚核苷酸。這點(diǎn)對(duì)于轉(zhuǎn)錄整體速率的控制非常重要起始成功后，酶釋放σ因子。核心酶離開啟動(dòng)子以便另一個(gè)聚合酶可以開始，這個(gè)過程叫做啟動(dòng)子清除（promoterclear），最小時(shí)間需1~2秒（是個(gè)相對(duì)長(zhǎng)的事件）啟動(dòng)子效率（efficiency）不同啟動(dòng)子間的序列差異很大，轉(zhuǎn)錄的效率可以相差1000倍-35序列，-10序列和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)周圍的序列都會(huì)影響到起始效率轉(zhuǎn)錄的頭30個(gè)堿基序列控制RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子的清除，因此影響到轉(zhuǎn)錄的速率和啟動(dòng)子的整體效率RNA鏈在起始反應(yīng)中的分離有些啟動(dòng)子在正常情況下不足以強(qiáng)大，需要另外活性因子（activatingfactor）的參與才能起始轉(zhuǎn)錄。例如，Lac

啟動(dòng)子Plac

需要cAMP受體蛋白（cAMPreceptorprotein，CRP）對(duì)啟動(dòng)子突變的分析-10序列下降突變：T/A→G/C-10序列上升突變：G→A；GT→AA可以用解鏈效應(yīng)解釋-10序列下降突變：T/A→A/T-35序列下降突變：G/C→T/A與核心酶、σ亞基的結(jié)合有關(guān)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)

Transcriptionstartsite90%的基因是嘌呤（purine）+1位點(diǎn)G比A更普遍通常起始位點(diǎn)的兩側(cè)是C和T（i.e.CGT或CAT）2.4.2延伸σ因子釋放后形成pol-DNA-RNA三元復(fù)合體（ternarycomplex

），酶會(huì)沿著模板前進(jìn)（啟動(dòng)子清除）RNA聚合酶不斷解旋前端DNA，其后端DNA重新螺旋。轉(zhuǎn)錄泡（Transcriptionbubble，DNA解旋區(qū)，~17bp）RNA的3’部分與DNA反義鏈形成雜交螺旋（hybridhelix

約12bp）E.coli

聚合酶平均的移動(dòng)速率~40nt/每秒，并與當(dāng)時(shí)的DNA序列相關(guān).起始與延伸2.4.3RNA鏈終止在終止子DNA序列處終止絕大多數(shù)終止信號(hào)（stopsignal）是RNA發(fā)夾（自身互補(bǔ)self-complementary）富含GC有益于這種結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定終止有Rho-依賴型和非依賴型RNA分離→

DNA復(fù)性→RNApol釋放終止子（Terminator）DNA的一段特殊序列，轉(zhuǎn)錄復(fù)合體在此分離Class1:ρ蛋白非依賴型自身互補(bǔ)組成莖環(huán)（stem-loop

）或發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)連續(xù)的腺苷酸（As）轉(zhuǎn)錄成RNA末端的一串尿苷酸（Us）Class2:ρ蛋白依賴型僅存在莖環(huán)或發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)E.coli.中一個(gè)ρ-非依賴的轉(zhuǎn)錄終止模型RNA轉(zhuǎn)錄本自身互補(bǔ)富含GC的序列穩(wěn)定使聚合酶停滯莖環(huán)后緊接的一串

Us（4個(gè)或更多）減弱RNA和反義DNA鏈的結(jié)合力，利于分離ρ-依賴的終止有些基因的終止子需要輔助因子ρ蛋白來介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的終止

RNA

的3’末端無連續(xù)的URho結(jié)合到單鏈RNA的特別位點(diǎn)Rho水解ATP從RNA鏈的初生端向轉(zhuǎn)錄復(fù)合體方向移動(dòng)，最終使聚合酶終止轉(zhuǎn)錄Rho蛋白（六聚體hexameric

蛋白）結(jié)合到RNA某個(gè)特定位點(diǎn)（72bp）沿初生的RNA鏈向RNApol復(fù)合體移動(dòng)在Rho

-依賴的終止子處停止轉(zhuǎn)錄復(fù)合體解離轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)——λtR1研究tR1，ρ依賴的終止子不加ρ蛋白的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大于16S，加入ρ蛋白，從右啟動(dòng)子（PR）轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物約9StR1轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)研究方法：RNaseT1（專一作用于RNA分子的GpN鍵，產(chǎn)物的末端為G-3’-P）分別消化9S和16SRNA9S產(chǎn)物（有5種產(chǎn)物）16S產(chǎn)物（僅一種產(chǎn)物）┅┅CAUACAUUCAAUCAAUUG在3’端的AUCAA任何一個(gè)核苷酸上都可以終止λtR1的突變分析活體內(nèi)tR1的轉(zhuǎn)錄終止有利于溶原（lysogene），轉(zhuǎn)錄繼續(xù)有利于裂解（lysis）有利于終止的突變cin1A：G/U→A/Ucin1Acnc1Ccnc8G不利于終止的突變cnc1C：U/A→C/Acnc8G：A/U→G/U終止效率體外轉(zhuǎn)錄，檢測(cè)各突變型離體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的長(zhǎng)短，表中數(shù)值為終止子后/前的比值比值大終止程度小，比值小終止程度大cin1A有利于終止cnc1C有利于連讀雙突變cnc1C的繼續(xù)轉(zhuǎn)錄效應(yīng)大大超過cin1A的終止效應(yīng)噬菌體不同時(shí)間后繼續(xù)轉(zhuǎn)錄％

25秒40秒55秒300秒300秒（＋ρ）λ＋041410020λcin1A－－－1009λcin1

cnc18892－9495轉(zhuǎn)錄與翻譯偶聯(lián)（coupling）無義突變和轉(zhuǎn)錄終止核糖體（ribosomes）參與轉(zhuǎn)錄的終止（后面轉(zhuǎn)錄調(diào)控還會(huì)提到）核糖體的翻譯阻止Rho蛋白趕上RNA聚合酶一個(gè)操縱子中，上游基因的突變不但影響自身的表達(dá)，還影響下游基因的表達(dá)；下游基因突變則不影響上游基因的表達(dá)多數(shù)極性突變是無義突變（nonsensemutant）或移碼突變突變位置越接近N端，表達(dá)的極性效應(yīng)越強(qiáng)；越接近C端越弱插入序列（IS）的極性效應(yīng)插入序列（insertionsequence）如IS1、IS2等DNA片斷插入基因中也產(chǎn)生極性效應(yīng)IS1：與插入方向無關(guān)，兩端有無義密碼子，形成一大段不翻譯區(qū)IS2：本身含有依賴于Rho蛋白的終止序列（tIS2），只有一種方向插入時(shí)產(chǎn)生極性效應(yīng)天然的極性現(xiàn)象，T7噬菌體，靠近啟動(dòng)子的基因轉(zhuǎn)錄效率高，遠(yuǎn)離的低?；蜷g的距離較遠(yuǎn)第三章 原核轉(zhuǎn)錄調(diào)控

RegulationofTranscriptioninProkaryotes操縱子（operon）全局性調(diào)控（globalregulation）σ因子指導(dǎo)的調(diào)控其他調(diào)控抗終止（anti-termination）反義控制（antisensecontrol）噬菌體策略3.1操縱子（operon）由Jacob和Monod于1961年首次提出操縱子概念基因表達(dá)和調(diào)節(jié)的單位，包括：結(jié)構(gòu)基因（Structuralgenes）在某個(gè)特定代謝途徑中的一組酶，它們被控制共同表達(dá)控制元件（Controlelements），比如操縱基因（operator）序列調(diào)節(jié)基因（Regulatorgene(s)）產(chǎn)物能夠識(shí)別控制元件（可以是不同操縱子上編碼的）控制元件結(jié)構(gòu)基因3.2E.Coli乳糖（lac）操縱子3.2.1結(jié)構(gòu)基因lacZ：編碼β-半乳糖苷酶（β-galactosidase），水解乳糖（lactose）為葡萄糖（glu）+半乳糖（gal）lacY：編碼半乳糖透過酶（permease）轉(zhuǎn)運(yùn)乳糖穿透細(xì)胞壁lacA：編碼半乳糖轉(zhuǎn)乙?；福╰ransacetylase）用于乳糖代謝基因lacZ,lacY,lacA是由一個(gè)啟動(dòng)子Plac

控制的轉(zhuǎn)錄單位lacZYA轉(zhuǎn)錄而來3.2.2操縱基因（operator）Olac：位于啟動(dòng)子Plac

3’-端

-5and+21與lac

阻遏物（repressor）結(jié)合3.2.3阻遏物（repressor）由LacI基因編碼，相同的亞基組成有活性的4聚體，與操縱基因（Olac）結(jié)合占用一26bp的回文（palindromic）序列同時(shí)，RNA聚合酶能夠與啟動(dòng)子結(jié)合，實(shí)際上阻遏物增加了聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合力約2個(gè)數(shù)量級(jí)聚合酶與Plac只能緊密結(jié)合而不能起始轉(zhuǎn)錄缺少誘導(dǎo)物（如乳糖）時(shí)阻遏物幾乎阻斷l(xiāng)acZYA所有的轉(zhuǎn)錄Lac啟動(dòng)子和操縱基因序列示阻遏物結(jié)合區(qū)的回文序列3’–TTAACACTCGCCTATTGTTAA–5’5’-(lacO1)-3’阻遏物4聚體的協(xié)同作用使結(jié)合的DNA成環(huán)（Loop）基因的表達(dá)方式1.組成性表達(dá)（constitutiveexpression）此類基因只受啟動(dòng)子與RNA聚合酶相互作用的影響，不受其他機(jī)制的調(diào)節(jié)。如管家基因（housekeepinggene）2.誘導(dǎo)/阻遏表達(dá)誘導(dǎo)（induction）--在特定環(huán)境信號(hào)刺激下表達(dá)增強(qiáng)的過程阻遏（repression）--表達(dá)產(chǎn)物水平降低的過程3.2.4誘導(dǎo)表達(dá)無誘導(dǎo)物時(shí)，阻遏物阻斷l(xiāng)acZYA所有的表達(dá)，但仍有極低水平的轉(zhuǎn)錄一旦出現(xiàn)乳糖，低水平的透過酶允許操縱子立即響應(yīng)。同時(shí)β-半乳糖苷酶能將乳糖部分轉(zhuǎn)變?yōu)楫惾樘牵╝llolactose）異乳糖作為誘導(dǎo)物與lac阻遏物結(jié)合并使之失活細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)誘導(dǎo)物是異乳糖異乳糖是半乳糖苷酶反應(yīng)的中間產(chǎn)物Gal(1→6)Glu誘導(dǎo)物（Inducer）乳糖作是天然的誘導(dǎo)物將聚合酶從啟動(dòng)子Plac

上釋放實(shí)驗(yàn)室常用的一個(gè)誘導(dǎo)物是合成的異丙基硫代半乳糖IPTG（isopropylthiogalactoside），因?yàn)椴槐话肴樘擒彰阜纸?，在?shí)驗(yàn)中的濃度可以保持恒定IPTG可以迅速誘導(dǎo)lac操縱子結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄很多載體上克隆基因的表達(dá)是被設(shè)計(jì)成用IPTG誘導(dǎo)LacZ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。如pUC19（以后再詳細(xì)介紹）突變分析下降突變（downmutant）上升突變（upmutant）i-、is、Oci和O造成的突變，乳糖（或誘導(dǎo)物IPTG）濃度可以調(diào)節(jié)誘導(dǎo)物不能調(diào)節(jié)的突變，對(duì)lacI-的解釋只能用啟動(dòng)子阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控ｉ基因在其自身的啟動(dòng)子Pi控制下，低水平、組成性表達(dá)產(chǎn)生阻遏蛋白R(shí)，每個(gè)細(xì)胞中僅維持約10個(gè)分子的阻遏蛋白無乳糖時(shí)，Lac操縱子處于阻遏狀態(tài)。R以四聚體形式與操縱基因Olac結(jié)合，阻礙了RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄起始R的阻遏作用不是絕對(duì)的，R與Olac偶爾解離，使細(xì)胞中還有極低水平的β-半乳糖苷酶及透過酶生成當(dāng)乳糖存在時(shí)(無葡萄糖)，乳糖受β-半乳糖苷酶的催化轉(zhuǎn)變?yōu)楫惾樘?，與R結(jié)合，使R構(gòu)象變化，R四聚體解聚成單體，失去與Olac的親和力，與Olac解離，基因轉(zhuǎn)錄開放，使β-半乳糖苷酶在細(xì)胞內(nèi)的含量可增加1000倍葡萄糖效應(yīng)E.Coli可以用乳糖作為碳源在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中，E.Coli只利用葡萄糖僅當(dāng)乳糖為唯一碳源時(shí)，乳糖代謝所需要的酶才被合成glucose＋＝葡萄糖代謝glucose＋，lactose＋＝葡萄糖代謝glucose－，lactose＋＝乳糖代謝3.2.5

CRPPlac

因?yàn)闆]有很強(qiáng)的–35區(qū)和–10區(qū)保守順序，Plac

啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的能力不強(qiáng)CRP（cAMPreceptorprotein）是與DNA結(jié)合后對(duì)轉(zhuǎn)錄起促進(jìn)作用的調(diào)節(jié)因子（正調(diào)控）單純因乳糖的存在發(fā)生去阻遏使lac操縱元轉(zhuǎn)錄開放，還不能使細(xì)菌很好利用乳糖，必需同時(shí)有CAP來加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，細(xì)菌才能合成足夠的酶來利用乳糖僅當(dāng)CRP

與cAMP（較高濃度）結(jié)合以后才起作用cAMP（濃度）由葡萄糖控制葡萄糖的代謝物抑制細(xì)胞內(nèi)cAMP形成有葡萄糖時(shí)，細(xì)胞內(nèi)cAMP低水平，CRP是無活性的二聚體，不能與DNA結(jié)合增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄葡萄糖消耗殆盡，高水平的cAMP與CRP蛋白結(jié)合3.2.6

CAP位點(diǎn)CAP（cataboliteactivationprotein）：分解代謝激活蛋白cAMP-CRP+乳糖啟動(dòng)子DNA，用DNaseI去除未保護(hù)的堿基，得到CAP結(jié)合位點(diǎn)（CAPbindingsite）CAP位點(diǎn)在啟動(dòng)子Plac上游端，與Plac部分重疊CAP位點(diǎn)具回文序列特征雙啟動(dòng)子假說體外轉(zhuǎn)錄分析不加cAMP-CRP的體外轉(zhuǎn)錄物有2種，分別是-22起始和+1起始啟動(dòng)子如果先加RNA聚合酶再加cAMP-CRP，從+1處起始轉(zhuǎn)錄，很慢啟動(dòng)子如果先加cAMP-CRP再加RNA聚合酶，從+1處起始轉(zhuǎn)錄，很快轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的是P1、P2（-35區(qū)）P1轉(zhuǎn)錄效率高，但與RNA聚合酶結(jié)合能力低P2轉(zhuǎn)錄效率低，但與RNA聚合酶結(jié)合能力高CRP調(diào)控模型當(dāng)細(xì)胞沒有cAMP-CRP時(shí)，RNA聚合酶優(yōu)先與P2結(jié)合，低轉(zhuǎn)錄水平當(dāng)cAMP-CRP與CAP位點(diǎn)結(jié)合時(shí)，RNA聚合酶與P1結(jié)合，轉(zhuǎn)錄效率高但實(shí)際上活體內(nèi)并無P2轉(zhuǎn)錄物CRP是正調(diào)控，與CAP位點(diǎn)結(jié)合時(shí)，可增強(qiáng)RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性，使轉(zhuǎn)錄提高50倍正控制（positivecontrol）：CAP蛋白負(fù)控制（negativecontrol）：阻遏物lac

操縱子轉(zhuǎn)錄控制區(qū)lac操縱元的強(qiáng)誘導(dǎo)既需要有乳糖的存在又需要沒有葡萄糖可供利用。通過這機(jī)制，細(xì)菌是優(yōu)先利用環(huán)境中的葡萄糖，只有無葡萄糖而又有乳糖時(shí)，細(xì)菌才去充分利用乳糖細(xì)菌對(duì)葡萄糖以外的其他糖（如阿拉伯糖、半乳糖、麥芽糖等）的利用上也有類似對(duì)乳糖利用的情況，在含有編碼利用阿拉伯糖的酶類基因群的阿拉伯糖操縱子（araoperon）、半乳糖操縱子（galoperon）中也有CAP結(jié)合位點(diǎn)，CAP也起類似的正性調(diào)控作用3.3CRP在gal操縱子中作用cAMP-CRP對(duì)gal操縱子的轉(zhuǎn)錄有激活作用（與lac操縱子相同）E.Coli的突變型cya-：cAMP環(huán)化酶缺陷crp-：CRP蛋白缺陷不能利用乳糖但可以利用半乳糖作為唯一碳源gal操縱子有兩個(gè)啟動(dòng)子，分別對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)是S1（+1）、S2（-5）有cAMP-CRP時(shí)，激活P1抑制P2，轉(zhuǎn)錄物從S1開始沒有cAMP-CRP時(shí)，轉(zhuǎn)錄物從S2開始突變分析半乳糖啟動(dòng)子的一個(gè)突變型不能利用半乳糖，但它再突變?yōu)閏ya-或crp-，又能利用半乳糖了突變發(fā)生在p1處，聚合酶無法從S1起始同時(shí)cAMP-CRP又抑制p2的轉(zhuǎn)錄，也無法從S2起始當(dāng)cya-或crp-突變，p2抑制解除，轉(zhuǎn)錄從S2起始，于是又能利用半乳糖了序列分析結(jié)果：-11位A→Tgal雙啟動(dòng)子的功能gal不僅作為能源和碳源，還是細(xì)胞壁的組成部分UDP-半乳糖是直接前體在不含半乳糖的培養(yǎng)基上，細(xì)胞須有一定量的差向異構(gòu)酶UDP-葡萄糖→差向異構(gòu)酶→

UDP-半乳糖。以葡萄糖培養(yǎng)時(shí)，無cAMP-CRP，P2啟動(dòng)，產(chǎn)生少量的酶以半乳糖培養(yǎng)時(shí)，cAMP-CRP濃度增加，抑制P2而促進(jìn)P1啟動(dòng)，保證細(xì)菌在兩種不同的環(huán)境中都能生長(zhǎng)3.4多操縱子調(diào)控全局調(diào)控（globalregulation）原核生物通過阻遏物或激活物的作用，通過許多單一的調(diào)節(jié)線路交織成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)操縱子進(jìn)行調(diào)控，以便生物對(duì)外界環(huán)境的壓力做出全面的適應(yīng)性反應(yīng)3.4.1調(diào)節(jié)子調(diào)節(jié)子（regulon）：受一種調(diào)節(jié)蛋白控制的一個(gè)或幾個(gè)操縱子構(gòu)成的調(diào)節(jié)系統(tǒng)一個(gè)調(diào)節(jié)子中的操縱子都屬于同一代謝途徑E.Coli麥芽糖調(diào)節(jié)子2個(gè)操縱子：malA、malB1個(gè)調(diào)節(jié)基因：malT3.4.2全局調(diào)節(jié)子全局調(diào)節(jié)子（globalregulon）：由一種調(diào)節(jié)基因/蛋白控制幾個(gè)不同代謝途經(jīng)的操縱子如cAMP-CRP對(duì)不同糖分解的調(diào)控SOS反應(yīng)熱激活（heatshock，放到后面講）3.5色氨酸（Trp）操縱子和弱化作用含5個(gè)編碼色氨酸（tryptophan）合成相關(guān)酶的結(jié)構(gòu)基因Otrp下游編碼一信號(hào)序列（前導(dǎo)區(qū)）僅當(dāng)細(xì)胞色氨酸的供應(yīng)短缺時(shí)，這些基因才被一致表達(dá)3.5.1結(jié)構(gòu)基因3.5.2阻遏物和Otrp阻遏物由遠(yuǎn)離的操縱子trpR編碼，與Otrp特異結(jié)合Otrp含有一長(zhǎng)18bp的回文序列，位于-21和+3，與Ptrp序列重疊trp阻遏物僅當(dāng)與Try組成復(fù)合物時(shí)才能與操縱基因Otrp結(jié)合，因此色氨酸是共阻遏物（co-repressor）Try作為終產(chǎn)物抑制自身的合成叫反饋抑制（feedbackinhibition）3.5.2阻遏表達(dá)阻遏物（二聚體）與Otrp結(jié)合，阻遏表達(dá)至少70倍3.5.3與阻遏不同的弱化作用色氨酸饑餓的E.coli加入色氨酸后，轉(zhuǎn)錄起始受阻，已經(jīng)開始的轉(zhuǎn)錄也受阻trp-tRNA的濃度調(diào)節(jié)trp操縱子的表達(dá)trpR+trpS+：trp-tRNA合成酶活性trpS-：溫度敏感突變型trpR+trpS+/trpR+trpS-：分別在30℃、42℃，含trp培養(yǎng)，分析Asase比活力上述結(jié)果顯示了trp-tRNA的類似阻遏作用弱化作用與阻遏作用比較弱化作用（Attenuation）也屬負(fù)調(diào)控，是輔助阻遏作用的一種精細(xì)調(diào)控

阻遏作用弱化作用調(diào)節(jié)強(qiáng)度>708～10mRNA全/無全/不完整作用位點(diǎn)OtrptrpL3.5.4前導(dǎo)區(qū)與弱化前導(dǎo)區(qū)（leaderregion）：操縱子（或單個(gè)結(jié)構(gòu)基因）中開始轉(zhuǎn)錄到結(jié)構(gòu)基因編碼開始位置之間的一段DNA前導(dǎo)區(qū)缺失分析：trp?LD102:trp?ED53:trpa-/trpa+：比值顯示前導(dǎo)區(qū)對(duì)轉(zhuǎn)錄的類似阻遏作用（見后表）前導(dǎo)區(qū)和阻遏物的差異品系trpR+trpR-trpR-/trpR+trp?ED530.1711.869trp?LD1021.3210076順式作用分析阻遏作用：trpR通過基因產(chǎn)物（阻遏蛋白）以反式方式而發(fā)生作用前導(dǎo)區(qū)：只作用于同一條染色體的結(jié)構(gòu)基因而不能作用另一條染色體上順式、反式作用分析：染色體上trpL缺失對(duì)質(zhì)粒上帶有trpL的色氨酸基因表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)前導(dǎo)區(qū)缺失株的順式效應(yīng)trpR-株比活力ASase（trpE）TSaseα2（trpA）trp+1.414.8trpΔA561.10.26trpΔE5016.5trpΔLC1415096.0trpΔE5/colVBtrpΔA562.717.0trpΔLC1415/colVBtrpΔA562.51023.5.5前導(dǎo)區(qū)的一級(jí)結(jié)構(gòu)162bp（trpE起始密碼子前）可以表達(dá)前導(dǎo)肽（leaderpeptide）有有效的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列，核糖體足跡）前導(dǎo)區(qū)27-68編碼14aa的多肽，其中第10、11位都是trp密碼子，稀有（E.coli蛋白質(zhì)中色氨酸的平均含量約1/100）有高效的ρ非依賴型終止子，GC豐富的莖環(huán)和8個(gè)連續(xù)的U，如果轉(zhuǎn)錄時(shí)形成發(fā)夾，僅產(chǎn)生140bp的轉(zhuǎn)錄本重組分析：trpL+LacI→i大細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（maxicell）DNA修復(fù)缺陷突變和重組缺陷突變的E.coli，在受到紫外線照射時(shí)染色體DNA嚴(yán)重?fù)p傷并降解?？墒羌?xì)胞中的質(zhì)粒沒有被紫外線擊中而繼續(xù)復(fù)制，由這些質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)繼續(xù)合成trpL重組質(zhì)粒→轉(zhuǎn)化Ecoli大細(xì)胞株→紫外照射6h→標(biāo)記培養(yǎng)→電泳檢測(cè)有14肽的合成氨基酸饑餓表達(dá)各種氨基酸缺陷型→非饑餓培養(yǎng)

→洗凈

→饑餓數(shù)分鐘

→3H-U標(biāo)記→雜交檢測(cè)前導(dǎo)肽中各氨基酸饑餓，檢測(cè)trp操縱子的mRNA量3.5.6前導(dǎo)區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)推測(cè)鏈的配對(duì)區(qū)RNaseT1不完全酶切→非變性膠→變性膠前導(dǎo)區(qū)RNA的RNaseT1酶解片斷非變性膠變性膠核苷酸大?。∟t）切點(diǎn)位置AA11~140不切或切在70－71A271~140A31~70BB1107~140107-108CC151/52~9551-52/52-5370-7195-96C271~95C351/52~70前導(dǎo)區(qū)的可變結(jié)構(gòu)前導(dǎo)區(qū)含4個(gè)互補(bǔ)的區(qū)域（鏈1－4）4條互補(bǔ)鏈可以形成可變的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中之一是弱化子（attenuator）熱力學(xué)分析的最穩(wěn)定結(jié)構(gòu)：鏈1與鏈2配對(duì)，鏈3與鏈4配對(duì)核糖體的狀態(tài)影響前導(dǎo)區(qū)轉(zhuǎn)錄物的結(jié)構(gòu)3.5.7弱化作用的普遍性存在前導(dǎo)區(qū)→可以翻譯為前導(dǎo)肽前導(dǎo)區(qū)富含編碼相應(yīng)氨基酸的密碼子前導(dǎo)區(qū)能形成可變的莖-環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)前導(dǎo)區(qū)的突變trpL29：AUG→AUA，增強(qiáng)終止His的突變分析hisO1242：組成型突變，E、F缺失hisO9654：赭石突變，CAA→UAA，缺陷型突變His-hisO9663：C/G→A/G，缺陷型突變His-

，配對(duì)功能喪失hisO9663：琥珀突變UAG，琥珀抑制基因，翻譯到E區(qū)UGA（適合野生菌）融合質(zhì)粒（hisL+lacZ）→帶琥珀抑制基因/不帶琥珀抑制基因→酶活力提高3倍以上3.6σ因子指導(dǎo)的調(diào)控σ因子：雙功能蛋白（bifunctionalprotein）與RNA聚合酶的核心酶結(jié)合識(shí)別特定的啟動(dòng)子區(qū)域（-35和-10）很多細(xì)菌能夠產(chǎn)生不只一種的σ因子，以應(yīng)付不同生長(zhǎng)環(huán)境下對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的要求E.coli:熱激活（Heatshock）bacillussubtilis（枯草芽孢桿菌）

：芽孢形成（Sporulation）由σ因子控制SPO1噬菌體σ因子組成級(jí)聯(lián)反應(yīng)3.6.1熱激反應(yīng)從30oC轉(zhuǎn)到42oC培養(yǎng)15秒，產(chǎn)生17種新蛋白繼續(xù)升高溫度到極端（43~47oC），E.coli只生產(chǎn)這些熱激活蛋白以維持生存熱激活蛋白（hightemperatureproductionproteinHTP）htpR-不再合成HTP蛋白，htpR的大小是32kd

32

又稱為

H

，由rpoH編碼

32

有自己特殊的啟動(dòng)子保守序列最普通的因子是

70

32和

70因子識(shí)別序列

保守序列

-35sequence-10sequence

標(biāo)準(zhǔn)

70

熱激活

32

---------------TTGACA-----16~18bp---TATAAT

--T--C--C---CTTGAA--13~15bp--CCCCAT--T3.6.2

芽孢形成由σ因子控制營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期末，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)停止，觸發(fā)芽孢形成復(fù)制的基因組DNA附在細(xì)胞的一端，隔膜（septum）形成產(chǎn)生兩個(gè)獨(dú)立的區(qū)域（不對(duì)稱分裂），分化為母細(xì)胞（mothercell）和前芽孢（forespore）一條染色體全部進(jìn)入前芽孢中前芽孢形成芽孢（spore），母細(xì)胞被溶解，芽孢釋放芽孢形成過程中，芽孢特異性基因表達(dá)，生長(zhǎng)期基因部分關(guān)閉?；镜恼{(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平

因子的調(diào)控調(diào)控原則是每個(gè)區(qū)域（compartment）中新的

因子不斷被取代，導(dǎo)致一系列不同基因被轉(zhuǎn)錄區(qū)域間的交流協(xié)調(diào)前芽孢和母細(xì)胞的時(shí)相性普通因子是

43（

A）轉(zhuǎn)錄出

F

，

H轉(zhuǎn)錄出前體

E。在隔膜形成前產(chǎn)生，無活性

F和

E分別轉(zhuǎn)錄前芽孢和母細(xì)胞中的基因前芽孢中

F通過磷酸化途徑激活，芽孢形成開始

F激活調(diào)控一：表達(dá)前芽孢早期基因（含

G），由

G表達(dá)前芽孢的晚期基因

F激活調(diào)控二：通過膜結(jié)合蛋白激活母細(xì)胞中前體

E母細(xì)胞中

E被

K置換，表達(dá)母細(xì)胞的晚期基因3.6.3

因子組成級(jí)聯(lián)反應(yīng)很多噬菌體可以合成自身的

因子接管宿主菌的轉(zhuǎn)錄機(jī)器芽孢桿菌的噬菌體SPO1（烈性噬菌體）表達(dá)級(jí)聯(lián)的（cascade）

因子，分別用來表達(dá)噬菌體的早期、中期和晚期基因噬菌體SPO1早期表達(dá)

28（gp28），誘發(fā)中期基因表達(dá)

33\3428基因突變，中期基因不再表達(dá)

33\34再次誘發(fā)晚期基因，使宿主RNA聚合酶順序性（squentialorder）表達(dá)噬菌體基因33、34基因突變，晚期基因不再表達(dá)宿主細(xì)菌的全酶識(shí)別早期啟動(dòng)子早期基因表達(dá)28σ33\34表達(dá)噬菌體的晚期基因σ28取代細(xì)菌的σ因子識(shí)別中期基因中期表達(dá)33和34取代σ28第四章 噬菌體策略

Phagestrategies

一些概念噬菌體（bacteriophage）：感染細(xì)菌的病毒（virus）噬菌斑（plaque）：噬菌體裂解宿主細(xì)胞的斑裂解感染（lyticinfection）：細(xì)菌被噬菌體感染后致使細(xì)菌死亡并釋放出子代噬菌體溶源（lysogeny）：噬菌體以原噬菌體形式成為細(xì)菌基因組中穩(wěn)定的組分而繼續(xù)存活原噬菌體（prophage）：噬菌體的基因組通過整合（integrate）成為細(xì)菌線性染色體的一部分免疫（immunity）：原噬菌體可以阻止同類其他的噬菌體感染同一個(gè)細(xì)胞誘導(dǎo)（induction）：原噬菌體通過誘導(dǎo)解除溶源化的限制1裂解周期（lyticcycle）有些噬菌體只有一種生存方式（strategy），在感染了一個(gè)易感宿主之后，破壞了宿主的功能而同時(shí)產(chǎn)生大量子代噬菌體顆粒，宿主細(xì)菌則裂解死亡一個(gè)典型的裂解周期中，噬菌體DNA（或RNA）注入宿主細(xì)胞，其基因以一定的順序轉(zhuǎn)錄，并且復(fù)制出噬菌體的遺傳物質(zhì)，合成噬菌體顆粒需要的蛋白質(zhì)成分。最后宿主細(xì)菌裂解而釋放出組裝好的子代噬菌體噬菌體顆粒（particle）感染（infection）附著（attach）DNA被注射進(jìn)細(xì)菌早期發(fā)育（earlydevelopment）產(chǎn)生DNA合成酶類DNA復(fù)制開始晚期發(fā)育（latedevelopment）產(chǎn)生基因組、頭、尾DNA包裝進(jìn)頭，尾附著裂解（lysis）細(xì)胞破裂釋放出子代噬菌體裂解發(fā)育的2個(gè)時(shí)期早期發(fā)育從噬菌體DNA進(jìn)入到復(fù)制開始。主要合成與DNA復(fù)制相關(guān)的酶（DNA合成、重組和修飾的酶），導(dǎo)致基因組不斷的復(fù)制和重組晚期發(fā)育從復(fù)制開始到細(xì)胞裂解釋放出子代噬菌體。噬菌體顆粒的蛋白質(zhì)成分被合成（結(jié)構(gòu)蛋白和裝配蛋白）噬菌體通常擁有保證使噬菌體DNA優(yōu)先復(fù)制的功能基因（復(fù)制起始或新的DNA聚合酶）；噬菌體的mRNA被優(yōu)先轉(zhuǎn)錄（改變RNA聚合酶的起始和終止能力或更換RNA聚合酶）噬菌體通常利用宿主的合成機(jī)器合成自己的蛋白質(zhì)

裂解發(fā)育的基因表達(dá)早期基因（earlygene）：最初階段必須依賴宿主轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)表達(dá)的基因（λ噬箘體中為早早期immediateearlygene）中期基因（middlegene）獲得早期基因編碼的調(diào)控蛋白后表達(dá)的基因（或稱遲早期delayedearlygene）晚期基因（lategene）中期基因編碼的調(diào)控因子控制的基因裂解表達(dá)的級(jí)聯(lián)控制噬箘體基因位置組成（遺傳圖譜）反映了裂解進(jìn)程的次序，它的操縱子是一個(gè)極其有序的結(jié)構(gòu)，編碼相關(guān)功能蛋白質(zhì)的基因成簇排列使得調(diào)控最為經(jīng)濟(jì)，使得裂解的進(jìn)程能由少數(shù)的調(diào)控開關(guān)控制裂解周期受到正調(diào)控，噬菌體的基因只有接受到恰當(dāng)?shù)男盘?hào)才被表達(dá)。在這個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，上個(gè)步驟合成的蛋白質(zhì)將是下一個(gè)步驟要表達(dá)的基因所必須的在每個(gè)表達(dá)的階段，一個(gè)或多個(gè)活躍的基因就是下個(gè)階段所需的調(diào)節(jié)因子，這些調(diào)節(jié)因子可以是一種新的RNA聚合酶、改變宿主RNA聚合酶特異性的sigma因子、或是能使之通讀的抗終止因子級(jí)聯(lián)控制的2種途徑轉(zhuǎn)錄起始：識(shí)別新的噬菌體啟動(dòng)子，用一種σ因子取代宿主酶的σ因子（spo1）或合成新的RNA聚合酶。新σ因子或RNA聚合酶生成后，早期基因表達(dá)可被終止抗終止作用：早期基因與下一期基因相鄰，由終止位點(diǎn)隔開。如果終止作用被阻止，RNA聚合酶便通讀至另一邊基因，這樣早期基因與晚期基因一起表達(dá)2溶源（lysogeny）另一些噬菌體有兩種存在方式：裂解和溶源溶源的結(jié)果是原噬箘體整合到細(xì)菌基因組上，并與細(xì)菌基因一起遺傳由于含有一個(gè)原噬箘體，溶源菌會(huì)對(duì)同樣類型的噬箘體產(chǎn)生免疫，一個(gè)細(xì)菌基因組只包含一個(gè)拷貝的同一類型的原噬箘體有兩種策略的噬菌體可以進(jìn)行溶源和裂解生活周期的交替溶原和裂解的相互轉(zhuǎn)化由裂解周期產(chǎn)生的一個(gè)噬菌體進(jìn)入一個(gè)新的宿主細(xì)胞后，或者會(huì)重復(fù)裂解周期，或者進(jìn)入溶源狀態(tài)，這取決于感染的狀態(tài)及噬菌體和細(xì)菌的基因型在誘導(dǎo)（induction）的過程中，原噬菌體被切除下來，從而脫離溶源生存方式約束獲得自由，產(chǎn)生一個(gè)自由的噬菌體DNA，由此進(jìn)行裂解旁路噬菌體以何種方式繁殖是由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)來控制的噬菌斑（plaque）最初一個(gè)噬菌體感染一個(gè)細(xì)胞，裂解釋放的子代噬菌體又感染旁邊的細(xì)胞，感染的連鎖反應(yīng)呈放射狀分布，逐漸形成一個(gè)噬菌斑烈性噬菌體形成清晰的噬菌斑溫和的噬菌體形成渾濁的噬菌斑3λ噬箘體的表達(dá)調(diào)控λ（lambda）噬箘體基因組：48502bp線性雙鏈DNA兩端有12堿基的粘性末端（cohesivecos），進(jìn)入細(xì)胞后變?yōu)榄h(huán)狀DNAλDNA環(huán)化后，晚期基因在轉(zhuǎn)錄時(shí)是完整的λ噬箘體基因組編碼約35個(gè)蛋白質(zhì)

λ噬菌體的操縱子早早期基因：PR、PL遲早期基因：PR、PL裂解晚期基因：PR、PL、PR’溶源晚期基因：PRE、PaQ、PI溶源維持基因：

PRM3.1

λ噬菌體的裂解途徑λ噬箘體DNA進(jìn)入一個(gè)新的宿主細(xì)胞后，裂解與溶源以相同的途徑啟動(dòng)第一階段是利用宿主的RNA聚合酶進(jìn)行早早期（immediateearly）基因的轉(zhuǎn)錄λ噬菌體只有兩個(gè)早早期基因，各自獨(dú)立地由宿主RNA聚合酶表達(dá)λ噬菌體的裂解級(jí)聯(lián)反應(yīng)建立在抗終止作用基礎(chǔ)上早早期基因的表達(dá)從啟動(dòng)子PR向右轉(zhuǎn)錄到tR1，可以表達(dá)

cro蛋白

cro蛋白有雙重功能：抑制阻遏物的合成（對(duì)裂解進(jìn)行是必需的）關(guān)閉早早期基因的表達(dá)（在裂解周期晚期已不需要）（cro在后面還要詳細(xì)介紹）從啟動(dòng)子PL向左轉(zhuǎn)錄到tL1，可以表達(dá)

N蛋白pN是一個(gè)抗終止子，它作用在nut位點(diǎn)將允許轉(zhuǎn)錄過程進(jìn)入遲早期基因從啟動(dòng)子

PR’向右轉(zhuǎn)錄到

tR’

，無任何編碼序列抗終止（antitermination）抗終止作用提供了病毒控制從早期基因到下一期基因表達(dá)轉(zhuǎn)變的一種機(jī)制抗終止作用依賴于基因位置的特殊安排：早期基因與接下來要表達(dá)的基因非常接近，由終止子隔開如果終止子位點(diǎn)被抑制，聚合酶越過通讀另一邊的基因，同樣的啟動(dòng)子繼續(xù)被RNA聚合酶識(shí)別新基因的表達(dá)只在于伸長(zhǎng)RNA鏈，使之在5′端含有早期基因，在3′端含有新的基因抗終止是正控制，病毒必須先合成早期基因的產(chǎn)物，然后才能表達(dá)下一組基因抗終止依賴特定的位點(diǎn)λ

噬菌體的pN能分別解除終止子tR1

、tL1等的終止作用pN的抗終止作用是高度特異性的，但抗

終止事件并不是由終止子tR1

和tL1決定的抗終止作用的識(shí)別位點(diǎn)在轉(zhuǎn)錄單位的上游，是在與作用完成的終止子位點(diǎn)不同的其它區(qū)域

pN

識(shí)別位點(diǎn)：nut位點(diǎn)（Nutilizationsite）nutL、nutR分別決定向左或向右抗終止作用nut位點(diǎn)nutL在PL的起始點(diǎn)和N編碼區(qū)域的開始之間，接近于起始子nutR位于cro基因的末端和tR1之間，接近于終止子qut位于起始子之前這個(gè)作用涉及rho-依賴性終止子的抗終止，但是pN也可抑制非依賴終止子的抗終止作用

PR遲早期基因表達(dá)從PR開始的遲早期（delayedearly）轉(zhuǎn)錄本表達(dá)轉(zhuǎn)錄一直到終止子tR3

，除了

cro外還有cII蛋白（溶源中重點(diǎn)介紹）O&P蛋白：噬菌體復(fù)制所必需Q蛋白：另一個(gè)抗終止因子，Q是晚期基因表達(dá)所必需的PL遲早期表達(dá)除了

N

蛋白，從PL

開始的早期轉(zhuǎn)錄本還表達(dá)：cIII、xis、int蛋白（后面溶源中介紹）裂解級(jí)聯(lián)依賴抗終止早早期宿主RNA聚合酶從PL、PR起始轉(zhuǎn)錄N和cro遲早期pN允許轉(zhuǎn)錄越過N和cro后繼續(xù)，產(chǎn)生pQ晚期從Q與S間的啟動(dòng)子PR’

開始，如果缺少了pQ，晚期轉(zhuǎn)錄將在tR3位點(diǎn)終止，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物194nt，為6SRNApQ出現(xiàn)后，抑制tR3的終止，6SRNA得以延伸晚期基因的轉(zhuǎn)錄不在特定點(diǎn)終止，持續(xù)轉(zhuǎn)錄所有晚期基因乃至走出這個(gè)區(qū)域晚期基因左端的轉(zhuǎn)錄時(shí)也有相似的情形，經(jīng)過重組功能區(qū)后仍繼續(xù)每個(gè)方向上進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄可能在聚合酶撞到一塊前就終止了3.2λ噬菌體的溶源途徑如果要在E.

coli

中建立溶源，λ噬菌體必需做到：合成阻遏物噬菌體整合到宿主染色體上既便噬菌體選擇溶源途徑，早早期基因的表達(dá)與裂解途徑相同PR遲早期表達(dá)pN作用下的遲早期轉(zhuǎn)錄，從PR開始一直到終止子tR3表達(dá)cII（其他蛋白在裂解中起作用，前面已介紹）cII是溶源生長(zhǎng)所需的轉(zhuǎn)錄激活因子，可以激活3個(gè)啟動(dòng)子：PRE、PaQ

和

PIcII不穩(wěn)定，對(duì)蛋白酶敏感cIII能夠保護(hù)cII防止其降解pN作用下的遲早期轉(zhuǎn)錄，從PL開始的轉(zhuǎn)錄表達(dá)cIII、xis、int（N蛋白不再介紹）cIII可以保護(hù)cII

蛋白cII單獨(dú)存在的半衰期<1min；有cIII時(shí)的半衰期~5minXis一般認(rèn)為是原噬菌體切除所必需的Int一般認(rèn)為是前噬菌體整合所必需的值得注意的是，這里的xis和int由于sib位點(diǎn)的反向調(diào)節(jié)（retroregulation），并不表達(dá)出蛋白PL

遲早期表達(dá)反向調(diào)節(jié)（retroregulation）在pN作用下，由PL的轉(zhuǎn)錄越過終止子，形成了核酸酶的靶位點(diǎn)sibsib首先被RNaseIII剪切，接著核酸外切酶從3’→5’降解mRNAsib是int基因下游的負(fù)調(diào)節(jié)位點(diǎn)，降解由下游向上游進(jìn)行，故稱為反向調(diào)節(jié)sib突變是阻止了RNaseIII識(shí)別靶位點(diǎn)，rnc-的突變具同樣效果由PI的轉(zhuǎn)錄在tI終止，具終止子結(jié)構(gòu)的mRNA穩(wěn)定，可以表達(dá)蛋白cII是溶源所必需的，沒有或者量不夠，λ都不能進(jìn)行溶原生長(zhǎng)cII是建立溶源所必需的，但維持溶源是不需要的細(xì)胞中cII的水平與宿主蛋白酶的水平相關(guān)HflA和HflB是兩類消化cII

的蛋白酶（HighFrequencyofLysogenization）基因hflA座位實(shí)際上編碼3個(gè)基因，其中HflC和HflK是消化cII

的蛋白酶HflB編碼的蛋白酶可以消化cII和s32宿主細(xì)胞的蛋白酶水平與生長(zhǎng)狀態(tài)相關(guān)，營(yíng)養(yǎng)豐富的細(xì)胞蛋白酶水平高，饑餓的細(xì)胞水平低與cII、cIII的基因劑量有關(guān)感染復(fù)數(shù)（multiplicityofinfection）10倍的細(xì)胞cII半衰期可以長(zhǎng)40～50倍野生型的模糊噬菌斑由于不同的moi引起誘導(dǎo)的不可逆性是由于原噬菌體的一份基因不足以重新建立起溶原CII激活的轉(zhuǎn)錄PROMOTERSEQUENCEPRETTGC

GTTTGT

TTGC<--

13-->AAGTATPITTGC

GTGTAA

TTGC<--

13-->TGTACTPaQTTGC

GAGCAC

TTGC<--

13-->TAGTATconservedcIIbindingsitesareshowninred;-35sequencesareingreen;-10sequencesareinblue.保守的cII

結(jié)合位點(diǎn)TTGC突變，將影響噬菌體建立溶原的能力PRE晚期表達(dá)由cII激活的轉(zhuǎn)錄，從啟動(dòng)子PRE開始的轉(zhuǎn)錄直接表達(dá)cI細(xì)胞中有cI蛋白的積累，就可以通過與操縱基因OR的結(jié)合激活自己的啟動(dòng)子PRM因?yàn)閺腜RE

轉(zhuǎn)錄的mRNA與cro的mRNA（從PR轉(zhuǎn)錄）有一段反義（anti-sense）序列，由于編碼區(qū)是雙鏈RNA而導(dǎo)致cro不能翻譯，這屬于反義控制（Antisensecontrol）PRM和PRERE：repressorforestablishmentoflysogenyRM：repressorformaintenanceoflysogeny由PRM起始轉(zhuǎn)錄的mRNA缺少SD序列，翻譯效率差由PRE起始轉(zhuǎn)錄的mRNA較長(zhǎng)，有SD（Shine-Dalgarno）序列，翻譯效果好，得到的cI蛋白量比由PRM啟動(dòng)得到的量多6～7倍PaQ晚期表達(dá)由于自我終止，從PaQ

開始的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是一段短的60nt的反義RNA，用于調(diào)節(jié)

Q蛋白的表達(dá)它與PR的mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列）互補(bǔ)，抑制Q蛋白的表達(dá)由PaQ、PRE啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄抵消（counteract）

cro和

Q

在推動(dòng)裂解進(jìn)程中的作用PI晚期表達(dá)由于PI位于xis的內(nèi)部，從PI開始的轉(zhuǎn)錄終止于tI，只有

Int

蛋白能表達(dá)，適合噬菌體整合為原噬菌體，進(jìn)行溶源化生長(zhǎng)3.3λ噬菌體的表達(dá)調(diào)控調(diào)控區(qū)：λ基因組內(nèi)與調(diào)控有關(guān)的基因和位點(diǎn)集中在cIII到cII范圍內(nèi)調(diào)控區(qū)內(nèi)有4個(gè)啟動(dòng)子，PR、PL、PRE、和PRM與乳糖操縱子不同，λ噬菌體的啟動(dòng)子P與操縱基因O序列相互重疊，且有6個(gè)與阻遏物（cI和cro）結(jié)合的位點(diǎn)OR3、OR2、OR1；OL3、OL2、OL1PR與OR2、OR1重疊；PL與OL2、OL1重疊；PRM與OR2、OR3重疊每個(gè)操縱基因上3個(gè)位點(diǎn)和阻遏物的親和力各不相同，這種差異對(duì)裂解或溶原途徑起重要的作用操縱基因每個(gè)操縱基因由17bp組成，之間間隔3～7bp，間隔序列大多為A/T6個(gè)序列相似，都表現(xiàn)一定程度的回文對(duì)稱性烈性突變（方框中的突變）減弱了回文對(duì)稱性，減弱了與cI的親和力合成的參考序列，有絕對(duì)的回文對(duì)稱性，具最大的親和力操縱基因突變操縱基因突變減弱對(duì)稱性的突變→結(jié)合cI的能力弱→溶原性弱→烈性噬菌體增強(qiáng)對(duì)稱性的突變→結(jié)合cI的能力強(qiáng)→溶源性強(qiáng)→溫和噬菌體間隔區(qū)突變OR3與OR2之間，

cI基因上游第33個(gè)堿基對(duì)：C/G→T/A，造成PRM啟動(dòng)功能缺陷OL2與OL1之間，

N基因上游第31個(gè)堿基對(duì)：C/G→T/A，破壞了PL的啟動(dòng)功能都發(fā)生在間隔區(qū)唯一的C/G對(duì)上調(diào)節(jié)蛋白cI、cII和cIII野生型的噬箘體感染，其噬菌斑渾濁而不透明，因?yàn)槠渲邪艘徊糠秩茉次戳呀獾募?xì)胞cI基因突變的結(jié)果會(huì)阻止溶源，因此噬菌斑只含有裂解的細(xì)胞，感染產(chǎn)生了透亮的噬菌斑（clearplaque，c），基因cI、cII和cIII就是由于他們所涉及的表型而得名cro

蛋白controlofrepressorandotherthings各種λ噬箘體突變型的溶原化頻率菌種溶原化頻率

+～4×10-1cI<10-5cII10-5~10-4cIII10-2~10-1cI蛋白是阻遏物cI基因突變→宿主不被溶源化→說明cI的作用是阻遏λ噬菌體的活動(dòng)（與lacI相似）cI的作用不但阻止原噬菌體活動(dòng)，也阻遏繼續(xù)感染的λ噬菌體的活動(dòng)（免疫性）→具反式功能→蛋白cIts在低溫（30℃）保持溶原，在高溫（42℃）裂解生長(zhǎng)，說明cI產(chǎn)物對(duì)溫度敏感→蛋白質(zhì)cI產(chǎn)物作用在λ噬菌體的特定位點(diǎn)λimm434、λimm21的免疫區(qū)被取代，可以在溶原化的細(xì)菌中復(fù)制繁殖cI蛋白是專一性的，一種噬菌體的阻遏蛋白只作用它本身的免疫區(qū)cI蛋白的結(jié)構(gòu)cI蛋白是一種酸性蛋白，由2個(gè)相同的亞基組成cI蛋白每個(gè)亞基236aa，兩端各有一個(gè)結(jié)構(gòu)域（domain）N端富含賴氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）(9/26,35%)，與操縱基因結(jié)合C端不但聚合為二聚體，并且能使兩個(gè)二聚體締合cI蛋白結(jié)構(gòu)分析遺傳學(xué)分析生化分析遺傳學(xué)分析基因內(nèi)互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)：一種λ

cIts先在34℃感染→獲得溶原化細(xì)菌→再用另一種λ

cIts去感染→再在42℃培養(yǎng)→觀察是否裂解互補(bǔ)：不裂解不互補(bǔ)：裂解在N端的突變型和在C端的突變型能夠互補(bǔ)同在N端或同在C端的突變型不能互補(bǔ)生化分析用木瓜蛋白酶水解cI蛋白，水解點(diǎn)集中在75～150氨基酸位置，N端和C端都不被水解，說明這兩個(gè)區(qū)域折疊起來甲基化分析cI蛋白/N端片段＋DNA→用硫酸二甲酯處理→嘌呤甲基化→（六氫吡啶溶液中）甲基化的嘌呤斷裂，而蛋白保護(hù)的DNA片段不斷裂N端片段與操縱基因結(jié)合的部位和完整cI蛋白與操縱基因結(jié)合的部位一樣分子量測(cè)定：C端片段可以聚合成為低聚物而N端片段不能聚合cI蛋白對(duì)操縱基因的保護(hù)1.OR1DNA中加入cI蛋白的N端2.OR1DNA中加入完整的cI蛋白3.OR1DNAcI與操縱基因的結(jié)合DNA(野生型或突變型)OR3OR2OR1OR+2521OR1-55-OR2-25-2OR1-OR2-25--OR1-OR3--25-cI蛋白N端與操縱基因的結(jié)合DNA(野生型或突變型)OR3OR2OR1OR+25251OR1-2525-OR2-25-1OR1-OR3--25-cI蛋白與3個(gè)操縱基因親和力：OR1>OR2≥OR3鄰近位點(diǎn)上的cI蛋白二聚體由于締合作用而有協(xié)同效應(yīng)cI蛋白的N端片段不具有協(xié)同效應(yīng)cI蛋白與操縱基因親和力cro蛋白的結(jié)構(gòu)和功能有66個(gè)氨基酸殘基cro蛋白與cI蛋白無序列同源性，但功能相似：以二聚體形式和操縱基因結(jié)合cro蛋白也能和OR1、OR2、OR3三個(gè)位點(diǎn)結(jié)合和cI蛋白結(jié)合力下降的突變和cro蛋白的結(jié)合力也下降cro蛋白與3個(gè)操縱基因親和力：OR3>OR2≥OR1沒有協(xié)同效應(yīng)cro蛋白與操縱基因的結(jié)合DNA(野生型或突變型)OR3OR2OR1OR+188OR1-18-OR2--8OR1-OR3--8-cro和cI對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響cro蛋白對(duì)cI基因和cro基因的轉(zhuǎn)錄都起負(fù)控制作用cI蛋白對(duì)cro基因的轉(zhuǎn)錄起負(fù)控制作用；對(duì)cI基因本身的轉(zhuǎn)錄既有正控制又有負(fù)控制cro蛋白和cI蛋白相互競(jìng)爭(zhēng)、相互制約，λ的調(diào)控存在于這兩種蛋白的相互作用中融合操縱子技術(shù)構(gòu)建融合操縱子質(zhì)粒lac

I的產(chǎn)物阻遏cI的表達(dá)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到特定的溶原性E.coli中由l

ORPRM

啟動(dòng)的lac

Z培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物-IPTG質(zhì)粒表達(dá)的cI蛋白對(duì)由ORPRM啟動(dòng)的lac

Z產(chǎn)生影響測(cè)定β-半乳糖苷酶的活力可以衡量這種影響把PRM換成PR

，可以研究cI蛋白對(duì)PR的影響把cI換成cro，可以研究cro蛋白對(duì)PRM、PR的影響

cI和cro對(duì)PRM、PR的影響