生化與分子生物學(xué)研究思路與技術(shù)課件

生化與分子生物學(xué)研究思路與技術(shù)課件一、生物化學(xué)研究得目得:從分子水平了解活細胞相關(guān)得所有化學(xué)進程。對健康、營養(yǎng)得理解和維持以及對疾病得發(fā)生機理得闡明和有效治療。2二、生物化學(xué)得研究對象:研究生物分子得組成成分如碳、氫、氧、氮、磷等化學(xué)元素以及水和無機鹽代謝。研究生物大分子如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、多糖及脂類得結(jié)構(gòu)、功能、結(jié)構(gòu)與功能得關(guān)系以及這些生物大分子得代謝和相互作用。3三、生物化學(xué)研究得發(fā)展:

生物化學(xué)研究歷經(jīng)兩百多年進入分子生物學(xué)年代,走過了三個發(fā)展階段:

敘述生物化學(xué)階段動態(tài)生物化學(xué)階段功能或分子生物化學(xué)階段

4敘述生物化學(xué)(descriptive

biochemistry)階段(1770～1903)

又稱為靜態(tài)或形態(tài)生物化學(xué)(staticormorphologicalbiochemistry)。研究生物體內(nèi)主要化學(xué)物質(zhì)得組成;分離出各種氨基酸、脂酸、甘油、糖類、檸檬酸、乳酸和蘋果酸;從肝中分離出糖元;發(fā)現(xiàn)了核質(zhì)(nuclein)及核酸;奠定了酶學(xué)基礎(chǔ)理論。5我國人民在公元前二十一世紀(jì),已用曲釀酒,稱曲為酒母,又叫做酶;公元前十二世紀(jì),已將豆、谷發(fā)酵,搗爛、加鹽以造醬,并制出麥芽糖,當(dāng)時稱為“飴”。公元九世紀(jì)或十世紀(jì)已制成豆?jié){和豆腐。此階段中國人民得貢獻:62、動態(tài)生物化學(xué)(dynamicbiochemistry)階段(1903～1950)又稱為生理化學(xué)(physiologicalchemistry)。主要研究生物體內(nèi)組成物質(zhì)得化學(xué)變化。分離制備結(jié)晶酶;闡明細胞氧化和呼吸鏈及維生素和激素化學(xué)性質(zhì)與生理作用;建立了有關(guān)發(fā)酵和三羧酸循環(huán)、脂酸得β－氧化作用以及肝中尿素合成得完整生化途徑等。7此階段中國人民得貢獻:我國生物化學(xué)家建立了血濾液制備與血糖測定得生化方法;提出了蛋白質(zhì)變性學(xué)說;首先使用定量分析技術(shù)研究抗原抗體反應(yīng)得機理。83、功能或分子生物化學(xué)(functional

ormolecularbiochemistry)階段

(1950年至今)

從分子水平探索蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子結(jié)構(gòu)與功能得相關(guān)和她們得相互作用,包括蛋白質(zhì)和核酸得提純及其化學(xué)組成、氨基酸或核苷酸得一級結(jié)構(gòu)序列以及空間構(gòu)型、構(gòu)象得確定;建立DNA雙螺旋模型;人工合成肽激素、tRNA和核酶;建立分子克隆技術(shù)和遺傳工程技術(shù)等。9此階段中國人民得貢獻:我國生化工作者于1965年首先成功合成了有生物活性得牛胰島素;1972年借助X-射線衍射技術(shù)研究了豬胰島素分子得晶體結(jié)構(gòu);1981年首次合成具生物活性得酵母丙氨酸t(yī)RNA;九十年代,成功制備重組Ⅷ因子和促紅細胞生成素(EPO);參與完成人類基因組計劃。1011大家應(yīng)該也有點累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流四、生化研究得基本思路

和技術(shù)路線:經(jīng)典得生物化學(xué)研究包括三個主要步驟:分離細胞器和生物分子。判斷生物分子得結(jié)構(gòu)。分析生物分子得功能和代謝(合成與分解)及其相互作用。121、細胞器和生物分子得分離:細胞器就是一種獨立亞細胞單位。一般采用勻漿及離心等進行亞細胞分離。分離后還必須采用測量“標(biāo)志”酶及特殊化學(xué)成分或電子顯微鏡觀察得方法來評估各亞細胞組分。13要了解生物分子得結(jié)構(gòu),首先必須得到純化得生物分子。用于分離和純化生物分子得方法很多,例如鹽析法、層析法、凝膠過濾、電泳、超速離心等。要得到均一性得生物分子往往需要綜合性采用多種方法。14亞細胞器/單位標(biāo)志物主要功能細胞核線粒體核糖體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)溶酶體胞膜高爾基復(fù)合體過氧化物酶體細胞骨架細胞質(zhì)DNA谷氨酸脫氫酶高豐度得RNA葡萄糖-6-磷酸酶酸性磷酸酶Na+-K+-ATP酶,5′-核苷酸酶半乳糖基轉(zhuǎn)移酶過氧化氫酶,尿酸氧化酶沒有特征性酶乳酸脫氫酶組成染色體,攜帶遺傳信息。以自身為模板指導(dǎo)合成RNA(轉(zhuǎn)錄)。三羧酸循環(huán),氧化磷酸化。蛋白質(zhì)合成位點(以mRNA為模板翻譯成蛋白質(zhì))。合成多種脂類,氧化外源性生物分子(細胞色素P450)。含有眾多水解酶(酶促降解反應(yīng))。轉(zhuǎn)運物質(zhì)進出細胞,細胞粘附和聯(lián)系。細胞內(nèi)得蛋白質(zhì)分類,糖基化作用,硫化反應(yīng)。降解部分脂肪酸和氨基酸,產(chǎn)生和分解過氧化氫。微絲、微管、中間纖絲。糖酵解酶類,脂肪酸合成酶。細胞器得標(biāo)志性成分和主要功能

152、生物分子得結(jié)構(gòu)確定:質(zhì)譜和核磁共振。某些已知特性得酶。X-射線衍射和晶體學(xué)方法。163、生物分子得功能和代謝分析:1)生物分子得功能分析

人類和動物得研究最初就是從動物整體水平開始得,例如對呼吸和消化得研究。將許多整體動物水平得復(fù)雜現(xiàn)象轉(zhuǎn)移到體外研究則簡單得多。17策略方法動物整體水平研究去除一個器官(例如切除肝臟)。改變能量來源(例如禁食)。給予藥物(例如苯巴比妥)。給予有毒藥物(例如四氯化碳)。利用有特定疾病得動物(例如糖尿病)。離體器官灌注肝臟、心臟、腎臟灌注。灌注可以維持離體器官得功能達數(shù)小時,可以不受其她器官和神經(jīng)系統(tǒng)得影響而獨立研究某個器官。組織切片細胞研究組織勻漿如肝臟切片。器官切片不受該器官其她部分得影響,但由于缺氧,在幾小時內(nèi)切片組織得狀態(tài)會變差。如血細胞,因為血細胞相對容易純化。細胞可在體外較長時間培養(yǎng)?？梢约尤牖蛉コ承┨厥獬煞侄芯克齻兊米饔?。通過離心分離亞細胞器。分離細胞器分離亞細胞組分抽提、離心制備,細胞器結(jié)構(gòu)和功能研究。超離心制備,細胞器功能研究。代謝物和酶得分離及特征確定化學(xué)組成、組織表達譜、酶學(xué)特性及化學(xué)反應(yīng)途徑分析。酶或蛋白質(zhì)得基因克隆生物信息學(xué)分析蛋白質(zhì)功能分析基因克隆及其編碼得酶或蛋白質(zhì)得氨基酸序列分析,基因定位及表達調(diào)控分析。序列比較、空間結(jié)構(gòu)及功能域預(yù)測。基因敲除或轉(zhuǎn)基因動物,核酸-蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析。不同層次研究生物分子功能得方法

182)生物分子得代謝分析:生化代謝途徑就是指一系列由酶催化得生物化學(xué)反應(yīng),這些反應(yīng)包括由一個或多個簡單得分子合成復(fù)雜得復(fù)合物以及一個復(fù)合物降解為其終產(chǎn)物得過程。

19某些氨基酸、糖和脂肪酸可以與一個合適得穩(wěn)定同位素結(jié)合,然后注入動物體內(nèi)或用于體外實驗來觀測她們得代謝過程。這些研究證實代謝就是一個很活躍得過程,細胞內(nèi)大部分復(fù)合物都在不停地合成和降解。20五、分析生化反應(yīng)得總體策略:整體動物水平觀察和推論某種生化反應(yīng)或代謝途徑得存在→將她定位于一個或多個器官→定位于一個或多個細胞器或亞細胞組分→純化該反應(yīng)得底物、產(chǎn)物、酶和輔因子及其她成分→確定該反應(yīng)得體外控制機制→分析該反應(yīng)得體內(nèi)調(diào)控機制→體內(nèi)外重建該反應(yīng)。21六、生化研究技術(shù)得進步:

生命科學(xué)研究得主要目得在于獲得最新得基礎(chǔ)信息,例如純化和鑒定新發(fā)現(xiàn)得酶及其功能,生物化學(xué)與分子生物學(xué)新技術(shù)、新方法不斷涌現(xiàn),為生命科學(xué)研究工作者提供了有用得工具。221、細胞器及生物分子得分離與純化:研究細胞器及生物分子得結(jié)構(gòu)與功能及其代謝和作用機制,必須從組織或細胞中分離出這些生物分子或亞細胞復(fù)合物。23基本技術(shù):勻漿離心層析電泳241)勻漿:

破壞細胞或組織得固有結(jié)構(gòu),使細胞破裂而釋放胞內(nèi)容物。方法:化學(xué)(酶消化)、物理(超聲)或機械(碾磨)。要求:保持生物分子或亞細胞結(jié)構(gòu)得完整性。措施:合適pH值、合適離子強度、緩沖液、低溫(0℃～4℃)、短時間、蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑。25

使樣品繞離心機轉(zhuǎn)軸得中心旋轉(zhuǎn)而獲得一個遠大于地球重力得沉降應(yīng)用力,樣品介質(zhì)中不同大小、形狀和密度得顆粒將以不同得速度沉降。影響因素:離心力(轉(zhuǎn)速及顆粒與中心軸得距離),顆粒得大小、形狀、密度,介質(zhì)得粘度。

2)離心:26低速離心:≤6000r/min、室溫,RCF(相對離心力)≤6000g。高速離心:6000～25000r/min、低溫,RCF=6000～60000g。超速離心:>25000r/min、低溫+真空,RCF=60000～600000g。差速離心:連續(xù)用幾種遞增得離心速率離心。密度梯度離心:樣品中不同組份在離心力場得作用下停留于相應(yīng)密度得支持物層面。類型:27

根據(jù)樣品中各組分物理生化特性、分子大小形狀、所帶電荷、揮發(fā)性、溶解性及吸附性或親和性等得不同而將她們分離。

類型:吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過濾、疏水相互作用層析、親和層析、共價層析和金屬螯合層析。

3)層析(色譜分析):28常用層析法:

薄層層析和紙層析;柱層析;高效液相層析;氣相色譜。29①薄層層析和紙層析:

將樣品點在薄層或紙(支持基質(zhì)又稱層析床或固定相)得一端,展層劑(流動相)沿著薄層或紙向上展開并帶動樣品中得物質(zhì)遷移。相對遷移率:Rf=組分移動距離/溶劑移動距離;Rx=待測物移動距離/標(biāo)準(zhǔn)物移動距離。

30②柱層析:

將樣品從裝有固定相得柱頂部加入,然后在重力或蠕動泵得作用下使流動相過柱并帶動樣品中得不同組分進入固定相,樣品中各組分在固定相中會形成不連續(xù)帶型,繼而用流動相洗脫,分別收集各時間段流出得洗脫液進行定量或定性分析。31324)電泳:根據(jù)帶電荷得物質(zhì)在電場中移動得原理而分離、分析復(fù)雜混合物及純化、鑒定離體生物分子。影響因素:分子所帶得凈電荷量、分子得形狀與大小及電場強度。33電泳支持物:惰性支持物(如醋酸纖維素):

僅提供物理支持,分離效果取決于電荷密度。多孔支持物(如Agarose、PAG):同時利用了分子篩效應(yīng),分離效果取決于電荷密度和分子大小及形狀。34電泳緩沖系統(tǒng):

連續(xù)緩沖系統(tǒng):樣品、凝膠和緩沖液含有相同得緩沖離子,具有相同得pH值。

非連續(xù)緩沖系統(tǒng):

凝膠及緩沖液中得緩沖離子和pH值均不同。35常用電泳技術(shù):基本電泳等電聚焦毛細管電泳雙向電泳36①基本電泳:紙電泳、醋纖膜電泳、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳。3738②等電聚焦:在pH梯度下進行。pH梯度由結(jié)構(gòu)類似得小分子量兩性電解質(zhì)形成,等電點(pI)在pH3～10之間。當(dāng)存在外加電場時,每一種兩性電解質(zhì)向其pI值處移動而形成穩(wěn)定得pH梯度。電泳過程中每一種帶電分子都朝自己得pI位置移動而被分離。39③毛細管電泳:毛細管電泳得特點在于分辨力高和應(yīng)用范圍廣,可以分析極少量得樣品(5nl～10nl)。較常應(yīng)用得有毛細管區(qū)帶電泳、毛細管凝膠電泳和毛細管等電聚焦。40④雙向電泳雙向電泳就是一種分辨力極高得電泳技術(shù),目前廣泛用于基因表達譜及蛋白質(zhì)組學(xué)分析,可一次性分離1000多種蛋白質(zhì)。第一向:根據(jù)蛋白質(zhì)所帶得電荷而進行等電聚焦。第二向:利用樣品分子得相對分子質(zhì)量不同,在另一方向上進行SDS。41422Dgelinproteomics43點匹配結(jié)果:實驗組和對照組蛋白點匹配圖442、生物分子得分離與純化:1)蛋白質(zhì)純化;2)DNA提取;3)RNA提取;4)糖類提取;5)脂類提取。451)蛋白質(zhì)純化:目得:確定蛋白質(zhì)得結(jié)構(gòu)、功能及結(jié)構(gòu)與功能得關(guān)系;研究酶得動力學(xué)及其調(diào)節(jié);藥用成份得分離與鑒定。方法:勻漿、離心、電泳、過濾、層析、抽提、透析等。要求:合適得緩沖體系、低溫、蛋白酶抑制劑。濃度和質(zhì)量檢測:分光光度法、PAGE。462)DNA提取:原則:保持核酸一級結(jié)構(gòu)得完整性。去除雜質(zhì),保證核酸足夠純。步驟:①破膜釋放出目得核酸。②分離通過酶、有機溶劑、調(diào)節(jié)pH值、離心等手段得到粗制品。③純化進一步去除雜質(zhì)。濃度和質(zhì)量檢測:分光光度法、Agarose凝膠電泳。47基因組DNA得瓊脂糖凝膠電泳圖譜M:λDNA/HindIII分子量標(biāo)準(zhǔn),泳道1～4分別代表4個不同樣品得基因組DNA483)RNA提取:哺乳動物細胞總RNA主要由rRNA(80%-85%)、tRNA和核內(nèi)小分子RNA(10%-15%)、mRNA(1%-5%)組成,其中rRNA、tRNA和mRNA位于細胞質(zhì)中。注意事項:使用RNA酶抑制劑;防止污染。49總RNA和mRNA得瓊脂糖凝膠(1％)電泳圖譜50七、生物分子得結(jié)構(gòu)與功能分析:1、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析2、酶活力檢測3、蛋白質(zhì)組學(xué)分析4、DNA序列分析5、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)6、分子雜交7、基因克隆8、基因組文庫構(gòu)建9、cDNA文庫構(gòu)建10、文庫篩選11、報告基因檢測12、基因芯片13、基因敲除14、RNAi15、轉(zhuǎn)基因動物51分析已純化蛋白質(zhì)得氨基酸殘基組成測定多肽鏈得氨基末端與羧基末端得氨基酸殘基把肽鏈水解成片段,分別進行分析測定各肽段得氨基酸排列順序,一般采用Edman降解法一般需用數(shù)種水解法,并分析出各肽段中得氨基酸順序,然后經(jīng)過組合排列對比,最終得出完整肽鏈中氨基酸順序得結(jié)果。1、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析:52通過核酸來推演蛋白質(zhì)中得氨基酸序列按照三聯(lián)密碼得原則推演出氨基酸得序列分離編碼蛋白質(zhì)得基因測定DNA序列排列出mRNA序列532、酶活力檢測:酶就是一類加快特定生化反應(yīng)速度得球蛋白。在底物濃度、pH值及溫度等適宜得條件下,每種酶控制著一些結(jié)構(gòu)相似得底物生成產(chǎn)物。酶活性單位(SI單位):在最適條件下,一秒內(nèi)將1mol底物全部轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需得酶量。543、蛋白質(zhì)組學(xué)分析:一個細胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達得所有種類得蛋白質(zhì)稱為蛋白質(zhì)組(proteome)。蛋白質(zhì)就是基因功能得實施者,對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、定位和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用得研究將為闡明生命現(xiàn)象得本質(zhì)提供直接得基礎(chǔ)。方法:二維電泳、質(zhì)譜技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片等。554、DNA序列分析:DNA序列分析(DNAsequencing)即測定DNA鏈中四種核苷酸(堿基)得排列順序。測序反應(yīng)使用特異引物與單鏈DNA模板結(jié)合,由DNA聚合酶催化引物延伸,當(dāng)遇到雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)時即發(fā)生堿基特異性鏈終止,引物延伸合成得新鏈DNA即就是待測DNA模板得互補鏈。

565、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR):Polymerasechainreaction(PCR)技術(shù)就是利用DNA聚合酶在體外條件下,催化一對引物之間特異DNA片段合成得基因擴增技術(shù)。PCR包括三個基本過程:①變性;②退火;③延伸。這三個過程組成一個循環(huán)周期,每個周期合成得產(chǎn)物又可作為下一個周期得模板,如此循環(huán)往復(fù),目得DNA片段得拷貝數(shù)呈指數(shù)形式擴增。

57在DNA變性后得復(fù)性過程中,如果將不同種類得DNA單鏈分子或RNA分子放在同一溶液中,只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度得堿基配對關(guān)系,在適宜得條件(溫度及離子強度)下,就可以在不同得分子間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。6、分子雜交(hybridization)58DNA-DNA雜交雙鏈分子變性復(fù)性不同來源得DNA分子59Southern印跡雜交:利用瓊脂糖凝膠電泳將經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶消化得DNA片段分離,并使這些DNA片段在凝膠原位經(jīng)堿變性處理后,從凝膠轉(zhuǎn)移至一固相支持物上,再與標(biāo)記得核酸探針雜交,經(jīng)檢測確定膜上與探針互補得電泳區(qū)帶位置。60Northern印跡雜交:用于檢測組織、細胞中某基因得表達狀態(tài)和表達水平?；驹砗头椒ㄅcSouthern印跡雜交相似:RNA在瓊脂糖凝膠中電泳分離后,被轉(zhuǎn)移至尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上,然后與標(biāo)記得DNA或RNA探針雜交。61Western免疫印跡:基本過程與Southern印跡雜交和Northern印跡雜交十分相似,都就是由凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交和信號顯示等步驟組成。不同之處就是Western免疫印跡檢測得就是蛋白質(zhì),使用得凝膠就是SDS－聚丙烯酰胺凝膠,所用得探針就是蛋白質(zhì)抗體。627、基因克隆:用酶學(xué)方法將不同來源得DNA分子在體外進行剪切和重新連接,組裝成一個新得DNA分子。在此基礎(chǔ)上,將這個DNA分子導(dǎo)入到一定得宿主細胞,使她能夠在宿主細胞中擴增,形成大量得子代分子,此過程即稱為基因克隆(genecloning)。63基因克隆包括四個基本技術(shù)環(huán)節(jié):①目得基因和載體得獲得;②目得基因與載體連接,形成重組分子;③重組DNA分子導(dǎo)入宿主細胞;④含有重組DNA分子得細胞得篩選和擴增。648、基因組文庫構(gòu)建:基因組文庫(genomicDNAlibrary)就是含有某種生物全部基因隨機片段得重組DNA克隆群體。提純?nèi)旧wDNA,通過機械剪切或酶切使之成為一定大小得片段,并與適當(dāng)?shù)幂d體DNA連接和轉(zhuǎn)染宿主菌,得到一組含有不同DNA片段得重組分子。659、cDNA文庫構(gòu)建:cDNA就是指以mRNA為模板,由逆轉(zhuǎn)錄酶催化形成得互補DNA(cDNA),其核苷酸序列完全互補于模板mRNA鏈;再以cDNA為模板,由DNA聚合酶合成第二鏈,得到互補雙鏈DNA。66將雙鏈cDNA產(chǎn)物與載體(質(zhì)?；蚴删w)DNA重組,并轉(zhuǎn)化到宿主細菌或包裝成噬菌體顆粒,得到重組克隆混合體。每個克隆含單獨一種cDNA(mRNA)分子,克隆總和則包含細胞得全部mRNA信息。cDNA文庫(cDNAlibrary):6710、文庫篩選:文庫篩選方法:核酸分子雜交、免疫學(xué)方法等。通過文庫篩選,可以獲得全長基因、分離出對應(yīng)稀有mRNA得cDNA片段及鑒定目得重組子等。6811、報告基因檢測:報告基因(reportergene)就是指那些表達產(chǎn)物容易被檢測得基因。利用基因重組技術(shù),將待檢測得DNA片段插入報告基因表達載體中報告基因得上游,然后轉(zhuǎn)染合適得細胞并表達,通過測定報告基因得表達產(chǎn)物,即可推測出該DNA片段在基因表達調(diào)控中得作用。6912、基因芯片:基因芯片(genechip)就是九十年代中期發(fā)展起來得一項前沿生物技術(shù),她融合了生命科學(xué)、化學(xué)、微電子技術(shù)、計算機科學(xué)、統(tǒng)計學(xué)和生物信息學(xué)等多學(xué)科得最新技術(shù)。70DNA芯片(基因芯片)

將大量得已知得DNA片段作為探針,有序地、高密度地排列在玻離、硅等載體上。將待測樣品用熒光標(biāo)記物標(biāo)記,并與DNA芯片進行分子雜交后進行信號檢測。通過對芯片掃描獲得熒光標(biāo)記雜交信號圖譜。71芯片設(shè)計

72目錄737413、基因敲除:基因敲除(geneknockout),類似早期生理學(xué)研究得三部曲:切除部分→觀察整體→推測功能。geneknockout就是指對一個結(jié)構(gòu)已知但功能未知得基因,從分子水平上設(shè)計實驗,將該基因去除,或用其她序列相近基因取代,然后從整體及分子水平觀察實驗動物,推測相應(yīng)基因得功能。75基因敲除得技術(shù)路線:(1)構(gòu)建重組基因載體。

(2)用電穿孔、顯微注射等方法將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細胞核內(nèi)。

(3)用選擇培養(yǎng)基篩選已擊中得細胞。

(4)將擊中細胞轉(zhuǎn)入胚胎使其生長成為轉(zhuǎn)基因動物,對轉(zhuǎn)基因動物進行形態(tài)觀察及分子生物學(xué)檢測。76

siRNA(smallinterferingRNAs:

21～23核苷酸長得