DBXM117-2021 露地辣椒疫病診斷與防治技術(shù)規(guī)程

ICSFORMTEXT65.020FORMTEXTCCSB05FORMTEXTDBFORMTEXT22DBFORMTEXT22/FORMTEXTXXXXX—FORMTEXT2021FORMTEXTFORMTEXT露地辣椒疫病診斷與防治技術(shù)規(guī)程FORMTEXTRegulationfordiagnosisandcontrolagainstPepperBlightinfieldFORMTEXT點擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識FORMDROPDOWNFORMTEXT（2021.11.26FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發(fā)布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實施FORMTEXT吉林省市場監(jiān)督管理廳??發(fā)布DB22/XXXXX—2021前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件中的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由吉林省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)本文件的主要起草人：王曉梅、陶淑霞、劉世杰、齊紅巖、葉雪凌、李宏俠、尹廣喜、王瑤、張丹、孫西琳、王國宇。露地辣椒疫病診斷與防治技術(shù)規(guī)程范圍本文件確立了露地辣椒疫病診斷與防治的程序，規(guī)定了癥狀診斷、病原菌診斷及綜合防治技術(shù)的操作指示。描述了記錄與檔案的追溯方法。本文件適用于露地辣椒疫病診斷及綜合防治。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T8321（所有部分）農(nóng)藥合理使用準(zhǔn)則NY/T1276農(nóng)藥安全使用規(guī)范總則術(shù)語和定義辣椒疫病pepperphytophthorablight由辣椒疫霉菌（PhytophthoracapsiciLeonian）侵染辣椒引起的一種菌物病害。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基potatodextroseagar，PDA一種用于分離和培養(yǎng)病原菌的營養(yǎng)基質(zhì)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction，PCR一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。交替用藥alternativeapplication選擇兩種或兩種以上無交互抗性的藥劑交替使用?；旌嫌盟巑ixedapplication選擇兩種或兩種以上作用方式和機(jī)制不同、無交互抗性的藥劑混合使用。病害診斷癥狀診斷辣椒疫病苗期和成株期均可發(fā)病，以成株期發(fā)病為主，根、莖、葉和果實都能發(fā)病。苗期癥狀苗期發(fā)病，發(fā)病初期在莖基部形成暗綠色水漬狀病斑，之后植株會迅速因褐腐縊縮而猝倒；有時莖基部呈黑褐色，嚴(yán)重時幼苗會枯萎而死。成株期癥狀根部染病，發(fā)病初期呈淡褐色濕腐狀病斑，逐漸變?yōu)楹诤稚瑢?dǎo)致根部及根頸部韌皮部腐爛，木質(zhì)部變淡褐色，引起整株萎蔫死亡，典型癥狀參見附錄A中圖A.1。莖和枝染病，發(fā)病初期病斑為水浸狀，環(huán)繞莖枝表面擴(kuò)展，導(dǎo)致莖枝黑桿，病部以上枝葉迅速凋萎，典型癥狀參見附錄A中圖A.2。葉部染病，產(chǎn)生邊緣不明顯的黃綠色病斑，病斑呈圓形或近圓形，病葉很快濕腐脫落。果實染病，發(fā)病部位始于蒂部，發(fā)病初期產(chǎn)生暗綠色水浸狀病斑，后期逐漸擴(kuò)大可遍及整個果實，病果迅速變褐軟腐，濕度大時，表面長出灰白色霉層，干燥后形成暗褐綠色僵果，殘留在枝上，典型癥狀參見附錄A中圖A.3。病原菌診斷顯微鏡觀察徒手制片取潔凈的載玻片，在載玻片中間滴一滴清水；用尖細(xì)的解剖針等直接挑取病部或培養(yǎng)基上的霉?fàn)钗铮们逅?；盡量使病原物分散；加蓋蓋玻片，在加蓋蓋玻片時，要使蓋玻片的一側(cè)邊緣與水滴邊緣接觸，然后慢慢向下放蓋玻片，若蓋玻片下有氣泡應(yīng)重新放置蓋玻片，待顯微觀察。鏡檢在普通光學(xué)顯微鏡物鏡10×10倍的視野下進(jìn)行形態(tài)觀察。菌絲無色，無隔膜，形態(tài)圖參見附錄B中圖B.1。游動孢囊梗3根～5根成束由葉背氣孔伸出，具3個～4個分枝，其頂端膨大形成游動孢子囊，游動孢囊梗膨大呈節(jié)狀，頂端尖細(xì),形態(tài)圖參見附錄B中圖B.2。游動孢子囊單胞無色，卵圓形，頂端有乳頭狀突起，大小為（23～40）μm×（18～22）μm,形態(tài)圖參見附錄B中圖B.3。分子檢測病原菌分離采集具有典型疫病病斑的辣椒病葉，在超凈工作臺上將病葉浸于75%酒精中表面消毒10s～30s，滅菌蒸餾水浸洗3遍，吸水紙吸干水后將病健交界處剪成5mm2～10mm2取4小塊病葉放置入PDA培養(yǎng)基中，25℃黑暗培養(yǎng)2d～4d，待菌絲長出后將其轉(zhuǎn)移至新的PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)3d～5d,待菌絲形成后，再進(jìn)行純化。菌落圖參見附錄DNA提取采用CTAB法，提取病菌基因組DNA。具體方法按附錄C中的C.1的要求執(zhí)行。PCR擴(kuò)增以基因組DNA為模板，采用通用引物ITS4/ITS5（ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’/ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’）對病原物ITS區(qū)域擴(kuò)增，PCR反應(yīng)參數(shù)按附錄C中的C.2的要求執(zhí)行。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果表明ITS片段大約為800bp，檢測結(jié)果參見附錄C中的圖BLAST比對PCR產(chǎn)物送交生物技術(shù)公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對分析，確定病原菌為辣椒疫霉菌（PhytophthoracapsiciLeonian）。辣椒疫霉菌的ITS序列參見附錄C中的C.4。綜合防治技術(shù)防治原則病害防治應(yīng)采取“預(yù)防為主，綜合防治”的原則。在優(yōu)先選用和栽培抗病品種的基礎(chǔ)上，加強(qiáng)栽培管理，重視農(nóng)業(yè)防治；科學(xué)利用化學(xué)防治，合理使用化學(xué)農(nóng)藥，采用交替用藥和混合用藥的方式，控制好用藥次數(shù)，避免病原菌產(chǎn)生抗藥性。防治方法品種選擇根據(jù)辣椒品種栽培習(xí)性及各地氣候條件，有針對性的選擇抗病或耐病的辣椒品種，優(yōu)先選擇兼抗兩種以上辣椒病害的品種進(jìn)行種植。農(nóng)業(yè)防治合理輪作與非茄科作物特別是玉米、大豆及十字花科蔬菜、蔥蒜類蔬菜等進(jìn)行3～5年以上輪作。清潔田園定植前徹底清理前茬作物的殘株、爛葉和雜草等；發(fā)現(xiàn)病株及時拔除，并帶出田外深埋或者燒毀；收獲后，也要徹底清除田間病殘體，集中燒毀。土壤消毒土壤采用生石灰消毒，80kg～100kg/畝，整地時深翻入土壤20cm，澆透水，一周后可以定植栽培。加強(qiáng)水肥管理移栽前畦面覆蓋地膜，采用膜下滴灌控制水分，保持土壤濕潤，增溫保墑。結(jié)合整地，施入適量腐熟好的有機(jī)肥作基肥；或每667m2施用商用有機(jī)肥400斤、過磷酸鈣30kg、硫酸鉀型復(fù)合肥30kg蹲苗結(jié)束后，澆一次透水，視辣椒生長情況，隨膜下滴灌追施全營養(yǎng)水溶肥，或高鈣高鉀水溶肥，并交替使用。田間管理辣椒開花前及時摘除門椒及以下側(cè)枝，辣椒坐果后及時去除殘留的花瓣，及時疏花疏果、整枝打杈，減少營養(yǎng)消耗，防止產(chǎn)量下降。辣椒成熟后，適時采摘，每次采收應(yīng)在農(nóng)藥安全間隔期后進(jìn)行?；瘜W(xué)防治農(nóng)藥選擇應(yīng)符合NY/T1276的規(guī)定，農(nóng)藥使用應(yīng)符合GB/T8321（所有部分）規(guī)定。藥劑管理按附錄D的農(nóng)藥管理中要求執(zhí)行。種子消毒播種前，首先是用52℃灌根法辣椒移栽定植成活后，可使用35%甲霜·霜脲氰水分散粒劑400～600倍液，每株灌藥液150mL左右，可間隔7-10d再次施藥，每季可使用3次。噴霧法發(fā)病前或發(fā)病初期，采用噴霧法施藥。噴霧要求均勻周到，每7d～10d噴灑1次，連續(xù)噴2次～3次。主要農(nóng)藥種類、使用時期、施藥量及施藥方法參考表1。15種防治辣椒疫病的農(nóng)藥種類及使用序號農(nóng)藥名稱及劑型使用時期施藥量（畝）150%烯酰嗎啉WP發(fā)病初期35～40g235%烯?！しぐ稴C發(fā)病前或發(fā)病初期60～70mL334%氟啶·嘧菌酯SC發(fā)病前或發(fā)病初期30～35mL4440g/L精甲·百菌清SC發(fā)病前或發(fā)病初期75～165mL550%嘧菌酯WG發(fā)病前或發(fā)病初期20-～36g680%烯酰嗎啉WG發(fā)病初期20～25g770%丙森鋅WP發(fā)病前或發(fā)病初期150～200g872%霜脲·錳鋅WP發(fā)病前或發(fā)病初期140～170g9500g/L氟啶胺SC發(fā)病前或發(fā)病初期25～30mL1075%甲硫·錳鋅WP發(fā)病初期84～120g1120%丁吡嗎啉SC發(fā)病前或發(fā)病初期130～145g1247%烯?！み蜞拙鶶C發(fā)病前60～80mL1370%代森錳鋅WP發(fā)病前或發(fā)病初期175～235g1423.4%雙炔酰菌胺SC發(fā)病前或發(fā)病初期30～40mL1550%錳鋅·氟嗎啉WP發(fā)病初期65～100gWP：可濕性粉劑；SC：懸浮劑；WG：水分散粒劑記錄與檔案應(yīng)及時詳細(xì)做好診斷與防治各環(huán)節(jié)的記錄，并建立檔案，保存完好，作為質(zhì)量追溯的憑證。檔案保存期限不低于2年。

（資料性附錄）

辣椒疫病病害癥狀圖片辣椒疫病不同發(fā)病部位典型癥狀圖根部癥狀莖部癥狀果實癥狀

（資料性附錄）

病原菌顯微形態(tài)及純化菌落形態(tài)病原菌顯微形態(tài)病原菌菌絲的形態(tài)(顯微鏡10X10倍數(shù))病原菌游動孢子囊梗(顯微鏡10X10倍數(shù))病原菌游動孢子囊(顯微鏡10X10倍數(shù))病原菌純化的菌落形態(tài)病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

（規(guī)范性附錄）

CTAB法提取病原菌基因組DNACTAB法提取基因組DNA具體操作步驟將清洗干凈的研砵，研杵及藥匙滅菌備用，配置好的CTAB提取液置于65℃先加入少量滅菌的石英砂于適量擴(kuò)繁的病菌菌絲體中迅速研磨后分裝于離心管中，再加入事先預(yù)熱的CTAB700μL，反復(fù)顛倒震蕩，使其充分混溶，65℃取出冷卻后，加入等體積的苯酚氯仿，輕輕翻轉(zhuǎn)，混勻后，常溫離心10min(12000rpm)。移取上清液至新離心管中，加入2倍體積的無水乙醇，輕輕轉(zhuǎn)動離心管，使DNA沉淀，待白色絮狀沉淀出現(xiàn)后，放置于-20℃棄上清液，吸取適量75％的酒精于離心管中，輕輕搖勻，離心5min（8000rpm），漂洗2次，晾干后，加適量TE緩沖液，4℃用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。PCR反應(yīng)體系和參數(shù)反應(yīng)體系ITS4和TIS5引物各加1μL，PCRmix12.5μL，DNA模板1μL，ddH2O9.5μL，無菌水補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)參數(shù)94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min共35個循環(huán)，72℃PCR產(chǎn)物檢測使用1％的瓊脂糖凝膠，用0.5×TBE電泳緩沖液，100V電泳30～40min；在凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行電泳結(jié)果觀察，判斷是否為預(yù)擴(kuò)增長度的條帶，無非特異性條帶，且濃度大于50ng/μL。交由生物公司純化并測序。PCR產(chǎn)物檢測確定病原菌為辣椒疫霉菌（PhytophthoracapsiciLeonian）,ITS序列片段大小為821bp。M樣品ITS經(jīng)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物電泳結(jié)果辣椒疫霉菌（PhytophthoracapsiciLeonian）的ITS全序列CGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCACACCTAAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCTTTTAGTTGGGGGTCTTGTACCCTATCATGGCGAATGTTTGGACTTCGGTCCGGGCGAGTAGCTTTTTGTTTTAAACCCATTTCACAATTCTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGATGTGCCAGATGTGAAGTGTCTTGCGTGTTGTCCTTCGGGTCGACTGCGAGTCCTTTTAAATGTACTGAACTGTACTTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTGTTGCTGGTTGTGGAGGCTGCCTGCGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTGCGGCGTTTAAAGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGGCGCTTATTGAATGCTTTTCCTGCTGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTTTGGCTTGGCTTTTGAATCGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGTGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGGTCGATCCATTTTGGGAATTTTGTGTGCACTTCGGTGCGCATCTCAATTGGACCTGATATCAGGCAAGATTACCCGCTATA

（規(guī)范性附錄）

農(nóng)藥管理采購不得采購國家禁止使用的農(nóng)藥，應(yīng)從正規(guī)渠