DB61-T 1815-2024 化妝品修護(hù)功效測(cè)試技術(shù)規(guī)范

ICS71.100.70CCSY42DB61TechnicalSpecificationforcosmeticsrepaireffi陜西省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布IDB61/T1815—2024前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14基本要求 25測(cè)試準(zhǔn)備 36測(cè)試 37數(shù)據(jù)分析 48測(cè)試報(bào)告 59質(zhì)量保證 5附錄A（資料性）圖片處理方法 6DB61/T1815—2024本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由陜西省藥品監(jiān)督管理局提出并歸口。本文件起草單位：陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院、陜西博溪通用檢測(cè)科技有限公司、陜西省藥品和疫苗檢查中心、陜西省藥品技術(shù)審評(píng)中心、咸陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心。本文件主要起草人：蔡虎、劉海靜、馮潤(rùn)東、曹涵博、楊文娟、吳小勇、黨琳琳、盧永波、李瀟、王莉芳、羅阿利、張若冰、李曉春。本文件首次發(fā)布。本文件由陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院負(fù)責(zé)解釋。聯(lián)系信息如下：?jiǎn)挝唬宏兾魇∈称匪幤窓z驗(yàn)研究院電話址：陜西省西安市高新區(qū)科技五路21號(hào)郵編：7100651DB61/T1815—2024化妝品修護(hù)功效測(cè)試技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了化妝品修護(hù)功效測(cè)試的基本要求、測(cè)試準(zhǔn)備、測(cè)試、數(shù)據(jù)處理、測(cè)試報(bào)告和質(zhì)量保證的要求。本文件適用于化妝品體外角質(zhì)形成細(xì)胞遷移率的測(cè)試。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T622化學(xué)試劑鹽酸GB/T646化學(xué)試劑氯化鉀GB/T678化學(xué)試劑乙醇(無(wú)水乙醇)GB/T1263化學(xué)試劑十二水合磷酸氫二鈉（磷酸氫二鈉）GB/T1266化學(xué)試劑氯化鈉GB/T1274化學(xué)試劑磷酸二氫鉀GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T21395二甲基亞砜SN/T3899化妝品體外替代試驗(yàn)良好細(xì)胞培養(yǎng)和樣品制備規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義SN/T3899界定的以及下列術(shù)語(yǔ)及定義適用于本文件。3.1修護(hù)repair有助于維護(hù)施用部位保持正常狀態(tài)。3.2細(xì)胞遷移cellmigration指細(xì)胞在接收到遷移信號(hào)或感受到某些物質(zhì)的刺激后而產(chǎn)生的移動(dòng)。3.3細(xì)胞鋪板率cellfusionrate細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿的面積占培養(yǎng)皿總表面積的百分比。2DB61/T1815—20244基本要求4.1環(huán)境要求4.1.1與細(xì)胞相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，潔凈度應(yīng)達(dá)到100級(jí)要求，環(huán)境溫度應(yīng)控制在20℃~24℃,環(huán)境濕度應(yīng)控制在50%～70%，防震動(dòng)，防電磁干擾。4.1.2其他試驗(yàn)操作應(yīng)在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下進(jìn)行，生物安全等級(jí)達(dá)到一級(jí)要求。4.2耗材和試劑4.2.1一般要求所用試劑應(yīng)為分析純，試驗(yàn)用水應(yīng)按GB/T6682的要求進(jìn)行制備。與細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑、耗材應(yīng)作無(wú)菌處理。4.3耗材耗材應(yīng)滿足下列要求：a)細(xì)胞培養(yǎng)瓶規(guī)格為25cm2、75cm2；b)細(xì)胞培養(yǎng)板為6孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板；c)無(wú)菌離心管規(guī)格為1.5mL、15mL、50mL；d)移液器槍頭為10μL、200μL、1000μL；e)過(guò)濾器孔徑為0.22μm；f)直尺長(zhǎng)度≥15cm。4.4試劑試劑應(yīng)滿足下列要求：a)二甲基亞砜應(yīng)符合GB/T21395的要求；b)無(wú)水乙醇應(yīng)符合GB/T678的要求；c)磷酸二氫鉀（KH2PO4）應(yīng)符合GB/T12745的要求；d)十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）應(yīng)符合GB/T12635的要求；e)氯化鈉（NaCl）應(yīng)符合GB/T12665的要求；f)氯化鉀（KCl應(yīng)符合GB/T6465的要求；g)鹽酸（HCl）應(yīng)符合GB/T6225的要求；h)角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基為無(wú)血清培養(yǎng)基；i)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)純度≥95%。4.5試劑配制試劑配制應(yīng)滿足以下要求：a)磷酸鹽緩沖溶液（0.1M，pH7.4稱定0.27g磷酸二氫鉀、2.87g十二水合磷酸氫二鈉、8.00g氯化鈉和0.20g氯化鉀加水800mL溶解，用鹽酸調(diào)pH至7.4，并加水定容至1000mL，過(guò)濾除菌，冷藏保存，有效期14d；b)EGF溶液（1ng/mL）：稱定10ngEGF標(biāo)準(zhǔn)品溶于10mL角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基中，配置成1ng/mL過(guò)濾除菌，冷凍保存，有效期28d。4.6儀器設(shè)備3DB61/T1815—2024儀器設(shè)備應(yīng)符合以下要求：a)倒置顯微鏡放大倍數(shù)為100倍～400倍；b)細(xì)胞培養(yǎng)箱條件為37℃,5%CO2，95%相對(duì)濕度；c)分析天平精度為0.0001g；d)移液器量程為100μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL；e)超凈工作臺(tái)潔凈度達(dá)到100級(jí)。5測(cè)試準(zhǔn)備5.1細(xì)胞準(zhǔn)備5.1.1應(yīng)采用人源皮膚的原代角質(zhì)形成細(xì)胞，以角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)液于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5.1.2測(cè)試前，宜取冷凍保存的角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)到P7代時(shí)，以2×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)試驗(yàn)組準(zhǔn)備3個(gè)復(fù)孔。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h±2h用于試驗(yàn)。5.1.3細(xì)胞接種前，應(yīng)在細(xì)胞培養(yǎng)板背面用記號(hào)筆和直尺橫向劃直線進(jìn)行標(biāo)記，每孔標(biāo)記2條線，兩條線間間隔距離宜為2.0cm。5.2樣品制備5.2.1受試物的配制應(yīng)根據(jù)受試物理化特性選擇合適的溶劑配置成受試物工作液，配制要求如下：a)水溶性物質(zhì)：宜選細(xì)胞培養(yǎng)液作為溶劑，配置成高濃度母液（母液中受試物的濃度應(yīng)為試驗(yàn)濃度的10倍～1000倍），過(guò)濾除菌，然后使用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋到試驗(yàn)濃度；b)非水溶性物質(zhì)：非水溶性物質(zhì)：宜選二甲基亞砜或無(wú)水乙醇作為溶劑，配置成高濃度母液（母液中受試物的濃度應(yīng)為試驗(yàn)濃度的100倍～1000倍），過(guò)濾除菌，其中二甲基亞砜或無(wú)水乙醇的體積在溶液中應(yīng)低于1%。5.2.2受試物濃度的選擇應(yīng)通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)確定受試物安全濃度范圍，以受試物處理細(xì)胞后細(xì)胞活力≥90%時(shí)的濃度為安全濃度的最高濃度，在安全濃度范圍內(nèi)，選擇1個(gè)～3個(gè)濃度作為受試物試驗(yàn)濃度。5.3實(shí)驗(yàn)分組試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)按以下要求分組：a)空白對(duì)照組：使用角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；b)陽(yáng)性對(duì)照組：使用含有陽(yáng)性物的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，陽(yáng)性物宜選擇具有顯著促進(jìn)人源角質(zhì)形成細(xì)胞遷移的活性物，如1ng/mLEGF；c)受試物組：使用含有一定濃度的受試物的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。6測(cè)試6.1受試物孵育4DB61/T1815—2024應(yīng)棄掉培養(yǎng)孔中的細(xì)胞培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液，操作過(guò)程按照5.3要求進(jìn)行，各組細(xì)胞孵育時(shí)間宜為24h±2h。6.2劃痕每孔細(xì)胞鋪板率應(yīng)達(dá)到90%～100%，劃痕過(guò)程中保持均勻力度，每孔應(yīng)有2個(gè)以上的觀察點(diǎn)（如圖1所示）。劃痕結(jié)束后，棄掉培養(yǎng)液，應(yīng)使用磷酸鹽緩沖溶液洗去脫落細(xì)胞，并于1mL磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行拍照觀察。圖16孔板劃痕示意圖6.3一次拍照劃痕結(jié)束后利用倒置顯微鏡進(jìn)行拍照，宜在放大倍數(shù)為4倍的物鏡對(duì)觀察點(diǎn)拍照，每孔拍攝不低于3張照片，記錄初始劃痕面積。6.4換液拍照結(jié)束應(yīng)棄掉磷酸鹽緩沖溶液，每孔更換為角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h±2h。6.5二次拍照孵育結(jié)束按照6.3要求記錄24h劃痕面積。7數(shù)據(jù)分析7.1圖片處理7.1.1計(jì)算初始和24h劃痕面積，圖片處理方法見附錄A。7.2數(shù)據(jù)計(jì)算每組應(yīng)取3個(gè)復(fù)孔的平均值作為檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）。計(jì)算公式見式（1）：Migrationrate=(S0h-S24h)/S0h×100%…………(1)式中：Migrationrate——遷移率（%0h——0h劃痕面積（cm2）；S24h——24h劃痕面積（cm2）。7.3統(tǒng)計(jì)分析5DB61/T1815—2024數(shù)據(jù)應(yīng)使用t檢驗(yàn)、雙尾檢驗(yàn)分析顯著性差異。與空白對(duì)照組相比，p<0.05則認(rèn)為其具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。7.4精密度試驗(yàn)中每組3個(gè)復(fù)孔的檢測(cè)數(shù)據(jù)的變異系數(shù)（CoefficientofVariation，C.V）應(yīng)≤20%。變異系數(shù)計(jì)算見式（2C.V=(SD/Mean)×100%…………(2)式中：C.V——變異系數(shù)(%)；SD——遷移率的標(biāo)準(zhǔn)差；Mean——遷移率的平均值。8測(cè)試報(bào)告宜包括但不限于以下幾個(gè)方面的內(nèi)容：——目的；——受試物信息；——方法；——數(shù)據(jù)與統(tǒng)計(jì)分析；——結(jié)果。9質(zhì)量保證9.1細(xì)胞接種24h后，細(xì)胞鋪板率應(yīng)達(dá)到70%～80%。9.2劃痕前每孔細(xì)胞鋪板率應(yīng)達(dá)到90%～100%。9.3與空白對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組的遷移率提升且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。6DB61/T1815—2024圖片處理方法以ImageJ圖像分析軟件為例，進(jìn)行圖片處理方法的說(shuō)明。A.1圖片統(tǒng)一化處理獲得照片后，應(yīng)進(jìn)行統(tǒng)一化處理。設(shè)置包含所有劃痕所在區(qū)域畫板，導(dǎo)入原始劃痕圖片，以記號(hào)筆標(biāo)記為基準(zhǔn)定位到同一位置，裁切劃痕圖片。經(jīng)過(guò)以上操作，可以保證兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的圖片取樣位置相同、圖片尺寸相同，具有可比性。A.2劃痕面積計(jì)算使用ImageJ軟件進(jìn)行劃痕面積的計(jì)算。導(dǎo)入要計(jì)算的圖片，執(zhí)行以下命令：a)Image-Type-8-bit黑白化處理；b)Process-Smooth畫面平滑；c)Process-Findedges增強(qiáng)邊緣顯示；d)Process-Filters-GaussianBlur-（Sigma值可自