高效液相色譜儀的測定原理及基本構(gòu)造

6.高效液相色譜儀的測定原理及基本構(gòu)造

一．

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1．

學(xué)習(xí)高效液相色譜法的測定原理；

2．

了解并掌握高效液相色譜儀（HP1100）的基本構(gòu)造。二．

實(shí)驗(yàn)原理：高效液相色譜法是重要的色譜方法，是在經(jīng)典液相色譜法和氣相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，（經(jīng)典液相色譜法使用粗粒多孔固定相，裝填在大口徑、長玻璃管柱內(nèi)，流動(dòng)相僅靠重力流經(jīng)色譜柱，溶質(zhì)在固定相的傳質(zhì)、擴(kuò)散速度極其緩慢，柱入口壓力低，僅有低的柱效，分析時(shí)間長；氣相色譜原理類似，流動(dòng)相為氣體，只能分離小分子量、低沸點(diǎn)的有機(jī)化合物，配合程序升溫可分析高沸點(diǎn)的有機(jī)化合物。）彌補(bǔ)了經(jīng)典液相色譜法和氣相色譜的缺點(diǎn)。它使用了多孔微粒固定相，裝填在小口徑短的不銹鋼柱內(nèi)，流動(dòng)相通過高壓輸液泵進(jìn)入高壓的色譜柱，溶質(zhì)在其中的傳質(zhì)、擴(kuò)散速度大大加快，從而在短時(shí)間內(nèi)獲得高的分離能力?？煞治龅头肿恿?、低沸點(diǎn)的有機(jī)化合物，更多適用于分析中、高分子量、高沸點(diǎn)及熱穩(wěn)定性差的有機(jī)化合物。由于80%的有機(jī)化合物都可以用高效液相色譜法分析，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物工程、制藥工業(yè)、食品工業(yè)、環(huán)境檢測、石油化工等行業(yè)。

根據(jù)使用的固定相及流動(dòng)相的極性不同，分為正相液相色譜和反相液相色譜：固定相為極性，流動(dòng)相為非極性的液相色譜色譜稱為正相液相色譜（固定相為硅膠和氧化鎂，流動(dòng)相為正己烷，醚等）；固定相為非極性，流動(dòng)相為極性的液相色譜色譜稱為反相液相色譜（固定相為碳粒和氧化鋁，流動(dòng)相為水、醇等）在液相色譜中，分離有機(jī)化合物，一般情況下用直接與標(biāo)準(zhǔn)物對照的方法，根據(jù)保留時(shí)間（t0）的不同進(jìn)行化合物的定性分析。當(dāng)未知峰的保留值與某一已知標(biāo)準(zhǔn)物完全相同，則能判定未知峰可能與已知標(biāo)準(zhǔn)物為同一物質(zhì)，特別是如果色譜柱條件改變，未知峰的保留值與已知標(biāo)準(zhǔn)物的保留值仍能一致，則基本判定是同一物質(zhì)；定性分析后，用峰面積進(jìn)行定量分析。標(biāo)準(zhǔn)物配成不同的標(biāo)準(zhǔn)，測定峰面積，作濃度和峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后據(jù)未知物的峰面積，在曲線上求濃度。高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。

1．液固色譜法使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個(gè)吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用于分離分子量200~1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。

2．液液色譜法使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個(gè)分配平衡過程。涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動(dòng)相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從擔(dān)體表面流失；溫度的變化和不同批號流動(dòng)相的區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動(dòng)相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用。現(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色譜法按固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。

正相色譜法采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動(dòng)相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。

反相色譜法一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右。隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機(jī)樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動(dòng)相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會(huì)使硅膠溶解，太低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。有報(bào)告新商品柱可在pH1.5~10范圍操作。正相色譜法與反相色譜法比較表

正相色譜法反相色譜法固定相極性高～中中～低流動(dòng)相極性低～中中～高組分洗脫次序極性小先洗出極性大先洗出3．離子交換色譜法固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進(jìn)行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分離。緩沖液常用作離子交換色譜的流動(dòng)相。被分離組分在離子交換柱中的保留時(shí)間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外，它還受流動(dòng)相的pH值和離子強(qiáng)度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進(jìn)而影響其與固定相的作用。流動(dòng)相的鹽濃度大，則離子強(qiáng)度高，不利于樣品的解離，導(dǎo)致樣品較快流出。離子交換色譜法主要用于分析有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。4．離子對色譜法又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。分析堿性物質(zhì)常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對。分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。離子對色譜法常用ODS柱（即C18），流動(dòng)相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行分離。被測組分保時(shí)間與離子對性質(zhì)、濃度、流動(dòng)相組成及其pH值、離子強(qiáng)度有關(guān)。5．排阻色譜法固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動(dòng)相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時(shí)間長；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動(dòng)相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。四．

儀器結(jié)構(gòu)：

1．

流動(dòng)相及儲(chǔ)液罐：儲(chǔ)液罐用耐腐蝕材料（玻璃、不銹鋼、氟材料等）；流動(dòng)相為液體（正相液相色譜常用：乙醚，氯仿，三氯甲烷等作溶劑；反相液相色譜常用：甲醇，乙腈，四氫呋喃和水作溶劑），使用前必須進(jìn)行脫氣，防止氣泡產(chǎn)生干擾。

2．

高壓輸液泵：耐壓1-400bar(40-50Mpa)，在分析過程中，色譜柱裝填5-10微米的固定相，對流動(dòng)相有很高的阻力，必須在高壓條件下才能完成流動(dòng)相及測試樣的穿透。

3．

進(jìn)樣裝置：通常有自動(dòng)進(jìn)樣、六通閥進(jìn)樣。

4．

色譜柱：為不銹鋼柱，內(nèi)有充填物，HP1100為C18柱，輔助有柱溫相裝置，平衡流動(dòng)相和室溫，減小誤差。

5．

檢測器：常用的有紫外吸收檢測器（UVD），折光指數(shù)檢測器（RID），電導(dǎo)檢測器（ECD），熒光檢測器（FD）。

折光指數(shù)檢測器（RID），電導(dǎo)檢測器（ECD）分別測定柱后流出液的總體折射率和電導(dǎo)率，測定靈敏度低，易受流量和溫度的影響，造成較大的漂移和噪聲，不適合痕量分析。

紫外吸收檢測器（UVD）和熒光檢測器（FD）分別測量溶質(zhì)對紫外光的吸收和溶質(zhì)在紫外光的照射下的熒光強(qiáng)度，檢測靈敏度高，不易受流量和溫度的影響，但不能用