DB12∕T 843-2018 綠豆源成分檢測(cè)定性PCR法

DB12DB12ICS65.020.20天津市市場(chǎng)和質(zhì)量監(jiān)督管理委員會(huì)發(fā)布綠豆源成分檢測(cè)定性PCR法Mungbean-derivedingredientsdetectio201811-07發(fā)布20181201實(shí)施天刖本標(biāo)準(zhǔn)按照GB刖本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.12009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市農(nóng)村工作委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所、浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所、天津市東麗區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：蘭青闊、陳笑蕓、王成、趙新、蘭璞、王永、王慶平、汪小福、黃鳳軍、秦志I根據(jù)綠豆源特異性序列設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)試樣進(jìn)行PCR擴(kuò)増。依據(jù)是否擴(kuò)増獲得預(yù)期的DNA片段，根據(jù)綠豆源特異性序列設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)試樣進(jìn)行PCR擴(kuò)増。依據(jù)是否擴(kuò)増獲得預(yù)期的DNA片段，判斷樣品中是否含有綠豆源成分。5.1除非另有說(shuō)明，僅使用分析純?cè)噭┖椭卣麴s水或符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。5.21mol/L氫氧化鈉溶液：在160mL水中加入8.0g氫氧化鈉N（aOH)，溶解后，冷卻至室溫，再加水定容到200mL。甲基氨基甲烷-鹽酸T（ris-HCl)、1.5g乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2)依次加入到100mL無(wú)菌去離條件下滅菌15min。5.4CTAB-Bbuffer:將1g十六烷基三甲mL無(wú)菌去離子水中，用1mol/L氫氧化鈉溶液（見(jiàn)5.1)調(diào)pH至8.0，加水定容至200mL。在103.4kPa(121C)條件下滅菌15min。1下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。本標(biāo)準(zhǔn)綠豆源成分特異性序列位于綠豆第5號(hào)染色體。綠豆源成分檢測(cè)定性PCR法2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了綠豆源成分的定性PCR檢測(cè)方法的原理、試劑和材料、儀器、分析步驟、結(jié)果分析和表述、檢出限。本標(biāo)準(zhǔn)適用于綠豆源成分的定性PCR檢測(cè)。225.10瓊脂糖。有致癌作用，配制和使用時(shí)應(yīng)戴一次性手套操作并妥善處理廢棄物。根據(jù)需要可選擇其他效果相當(dāng)?shù)暮怂崛玖洗驿寤义V作為核酸電泳的染色劑。體積混合。5.17綠豆源特異性引物：5.19石蠟油。5.22PCR產(chǎn)物回收試劑盒。6.3電泳槽、電泳儀等電泳裝置。6.4紫外透射儀。6.5凝膠成像系統(tǒng)或照相系統(tǒng)。6.6重蒸餾水發(fā)生器或超純水儀。3636.7其他相關(guān)儀器和設(shè)備。7.1DNA提取;轉(zhuǎn)移上清液至新轉(zhuǎn)移上清液至新的潔凈2.0mL離心管中；加入0.6倍體積的異丙醇，充分混勻；16000g離心10min，完全蒸發(fā)，加入100HL無(wú)菌去離子水溶解沉淀，所得溶液即為綠豆DNA，-20C貯存?zhèn)溆谩?.2DNA的濃度和質(zhì)量DNA溶液的0D260/0D280值應(yīng)在1.7?2.0之間，或質(zhì)量能復(fù)合檢測(cè)要求。7.3PCR擴(kuò)增7.3.1.1每一個(gè)試樣PCR反應(yīng)設(shè)置3次重復(fù)。儀可不加）。7.3.1.5反應(yīng)結(jié)束后取出PCR管，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。7.3.2.1在試樣PCR擴(kuò)増的同時(shí)，應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。7.4PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)按20g/L的質(zhì)量濃度稱取瓊脂糖，加入1XTAE緩沖液中，加熱溶解，配制成瓊脂糖溶液，每100mL瓊脂糖溶液中加入5HLEB溶液，混勻，稍適冷卻后，將其倒入電泳板上，插上梳板，室溫下凝固合成凝膠后，放入1XTAE緩沖液中，垂直向上輕輕拔去梳板。取12HLPCR產(chǎn)物與3HL加樣緩沖液混合后加入凝膠點(diǎn)樣孔，同時(shí)在其中一個(gè)點(diǎn)樣空中加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，接通電源在2V/cm?5V/cm條件下電泳檢測(cè)。電泳結(jié)束后，取出瓊脂糖凝膠，置于凝膠成像儀上或紫外透射儀上成像。根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)電泳結(jié)束后，取出瓊脂糖凝膠，置于凝膠成像儀上或紫外透射儀上成像。根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)擴(kuò)増條帶的大小，將電泳結(jié)果形成電子文檔存檔或用照相系統(tǒng)拍照。如需通過(guò)序列分析確認(rèn)PCR擴(kuò)増片段是否為目的DNA片段，按照7.5和76的規(guī)定執(zhí)行。7.6PCR產(chǎn)物回收按PCR產(chǎn)物回收試劑盒說(shuō)明書(shū)，回收PCR擴(kuò)増的DNA片段。7.7PCR產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證將回收的PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序，與綠豆源成分特異性序列（參見(jiàn)附錄A)進(jìn)行對(duì)比，確定PCR擴(kuò)増的DNA片段是否為目的DNA片段。8結(jié)果分析和表述8.1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果綠豆源成分的PCR擴(kuò)増產(chǎn)物大小為470bp，參見(jiàn)附錄A在符合綠豆源成分的PCR產(chǎn)物大小為470bp的情況下，被檢樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)：一一PCR擴(kuò)増產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果陰性者判為不含綠豆源成分，表述為“未檢出綠豆源成分”；一一PCR擴(kuò)増產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性者判為含有綠豆源成分，表述為“檢出綠豆源成分”。本標(biāo)準(zhǔn)方法的檢出限為1%(含靶序列樣品DNA/總樣品DNA)。4(資料性附錄）綠豆源成分特異性序列注：劃線部分為Mungbean—470bp—F和Mungbean—470bp—R弓丨物序列。s1TGAATGAGAGTGGTGTGAGTGAGAATAACAATCCAAGTGGCAGTCTTAACTATGAACACA61GACAAGGAAGCAAAGTAGCAATGATATAAAATGTTCAGAATCAAATTGCAGAATCCATTA121ATAAAATTTTGTAATGCAGAAGTAAGGAAAAAGTAATGTGTCCATAACACTATCCTTGCG181CTCATACTAGCTCCCCAATTTGTTTGCCTCATGCTATTATTGATCAACTACCTTATATTC241AATTCAATTCTAGATTGTAAGCACTTAAAAAATCAAGAATCTAAGAAAACAAATGCTGCA301ATGCAACCTCAACTGAAGGTAGTACAAACAGGATTGAGAAAAAGAGAGCAACAAAATAAG361AAAAAAAAGGCATAAAGAAAGTTAGCCAGTTATCATAGTTCCAGCACCTTCATCAGTTAA421AATCTCGAGCAACAAAGAGTGAGGAACCCTACCATCAATAATACTCGCGG(資料性附錄）PCR檢測(cè)反應(yīng)體系體積PCR檢測(cè)反應(yīng)體系見(jiàn)表(資料性附錄）PCR檢測(cè)反應(yīng)體系體積PCR檢測(cè)反應(yīng)體系見(jiàn)表B.1。PCR檢測(cè)反應(yīng)體系終濃度ddH2O10xPCR緩沖液25mmol/L氯化鎂溶液10pmol/L下游引物DNA聚合酶試劑—1.5mmol/L0.2mmol/L0.4^mol/L0.4^mol/L2.51.5625mg/LDNA模板2.0