溶血性曼氏桿菌診斷技術(shù)規(guī)范

1溶血性曼氏桿菌病診斷技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了溶血性曼氏桿菌病的診斷技術(shù)。本文件適用于牛、羊飼養(yǎng)場(戶)和動(dòng)物診療單位對(duì)牛、羊臨床樣本和分離培養(yǎng)物中溶血性曼氏桿菌的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款，其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語與定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。Mh：溶血性曼氏桿菌（Mannheimiahaemolytica）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）bp：堿基對(duì)（basepair）dNTPs：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphates）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）TSA：胰蛋白胨大豆瓊脂（trypticsoyagar）TSB：胰蛋白胨大豆肉湯（trypticsoybroth）PBS：磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersolution）ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinkedimmunosorbentassay）5流行病學(xué)由溶血性曼氏桿菌引起的牛、羊呼吸道疾病一年四季均發(fā)，秋冬季多見。6臨床診斷26.1臨床癥狀發(fā)病牛、羊主要臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、流涕，并伴有體溫升高、精神沉郁、厭食等。發(fā)病初期動(dòng)物呼吸速率加快，繼而出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸困難，呼吸伴有啰音。6.2病理變化臨床病理變化以纖維素性滲出性肺炎、大葉性肺炎和胸膜肺炎為主。剖解后可見以下病理變化中一項(xiàng)或多項(xiàng)：病變肺質(zhì)地堅(jiān)實(shí)、間質(zhì)增寬水腫、胸腔臟層和壁層均有纖維素附著、胸腔積液呈黃色或紅黃色、肺胸腔黏連。6.3結(jié)果判定牛、羊出現(xiàn)6.1或6.2的情況，可判定為疑似溶血性曼氏桿菌感染。確診應(yīng)采集有臨床癥狀或病理變化的牛羊鼻拭子、肺臟等組織或無菌采集血清，按實(shí)驗(yàn)室診斷方法確診。7實(shí)驗(yàn)室診斷樣品的采集與處理7.1器材7.1.1冷凍高速離心機(jī)。7.1.2組織勻漿器或研磨器。7.1.3手術(shù)剪刀和鑷子。7.1.4一次性密封袋。7.1.55mL凍存管。7.1.62mL凍存管。7.1.7采血針。7.1.8促凝采血管。7.2試劑7.2.1TSB培養(yǎng)基（配制方法見附錄A中的A.1）。7.2.20.01mol/LPBS溶液（配制方法見A.2）。7.2.375%酒精。7.3病料采集7.3.1將棉簽伸入鼻腔內(nèi)吸取分泌物，所有拭子采完后分別放入盛有3mLTSB培養(yǎng)基的5mL凍存管中，編號(hào)，記錄。采集的樣品密封后，采用保溫箱加冰密封后運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。7.3.2采集新鮮解剖的未破損的牛、羊肺臟，氣管注入50mL～100mL滅菌的0.01mol/LPBS溶液,輕揉肺臟3min～5min,轉(zhuǎn)移5mL～10mL灌洗液分裝至2mL滅菌的凍存管中，采用保溫箱加冰密封后運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。37.3.3將發(fā)病牛、羊剖檢后取肺、脾、肝等臟器和淋巴結(jié)組織，編號(hào)，記錄。采集的樣品密封后，采用保溫箱加冰密封后運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。7.3.4采用75%酒精對(duì)待采血?jiǎng)游镱i部靜脈表面皮膚進(jìn)行擦拭消毒。用無菌采血針于頸靜脈處采血，立即插入促凝采血管中，充分混勻后編號(hào)、記錄，采用保溫箱運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。7.4樣品處理7.4.1將采集鼻拭子中的棉簽擰干取出，5000r/min,離心20min。用5mL注射器吸出拭子液上清，分裝到2mL滅菌的凍存管中。貼標(biāo)簽-80℃冰箱保存。7.4.2將組織樣品分解成2×2×3cm大小，將上述組織塊，用無菌剪刀剪碎后，加入5mL保存液，研磨成組織懸液凍融3次或超聲波裂解，8000r/min，離心20min。用5mL注射器吸出上清，分裝到2mL滅菌的凍存管中。貼標(biāo)簽-80℃冰箱保存。7.4.3在4℃下，促凝管5000r/min,離心20min，取血清，分裝到2mL滅菌的凍存管中。貼標(biāo)簽-80℃冰箱保存。8細(xì)菌分離與鑒定8.1器材8.1.1高壓滅菌鍋。8.1.2恒溫培養(yǎng)箱。8.1.3光學(xué)顯微鏡。8.1.4生物安全柜。8.1.5細(xì)菌培養(yǎng)皿。8.2試劑8.2.1TSA培養(yǎng)基（配制方法見A.3）。8.2.2革蘭氏染色試劑：草酸銨結(jié)晶紫染色液、番紅染色液、碘液和95%酒精，2℃~8℃條件下保存。8.2.3葡萄糖、阿拉伯糖、靛基質(zhì)等微量生化鑒定管，2℃~8℃條件下保存。8.3細(xì)菌分離8.3.1在無菌條件下，用接種環(huán)將按一定比例稀釋的鼻拭子液、支氣管肺泡灌洗液或發(fā)病牛羊的肺、脾、肝等組織材料劃線接種于TSA平板中，37℃培養(yǎng)24h，使之形成菌落，以供鑒定用。8.3.2取8.3.1中培養(yǎng)的圓形、光滑、濕潤和半透明菌落，在TSA平板上進(jìn)行劃線接種純培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24h后，出現(xiàn)上述菌落（見附錄B.1）。8.4涂布染色鏡檢8.4.1涂布：在載玻片上滴加1～2滴滅菌蒸餾水后，用接種環(huán)挑取純培養(yǎng)的少量細(xì)菌與滅菌蒸餾水混勻并涂成薄菌膜。48.4.2干燥：將涂片至于空氣中自然晾干。8.4.3固定：將已干燥的載玻片涂面朝上，在酒精燈火焰上通過1～2次進(jìn)行固定，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。8.4.4染色：采用革蘭氏染色法進(jìn)行染色，一般包括初染、媒染、脫色和復(fù)染四個(gè)步驟，置1000倍（10×100）光學(xué)顯微鏡下觀察。8.4.5鏡檢：溶血性曼氏桿菌為革蘭氏陰性的球桿菌，菌體大?。?.3～0.5）μm×（1.0～1.8）μm，無芽孢、無鞭毛，有莢膜，可見兩極著色（見附錄B.2）。8.5生化鑒定溶血性曼氏桿菌可發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、木糖、蔗糖和甘露醇，不發(fā)酵海藻糖和阿拉伯糖，靛基質(zhì)試驗(yàn)、鳥氨酸脫羧酶試驗(yàn)和脲酶試驗(yàn)陰性，可作進(jìn)一步鑒定。9PCR檢測(cè)9.1器材9.1.1PCR擴(kuò)增儀。9.1.2電泳儀。9.1.3水平電泳槽。9.1.4凝膠成像系統(tǒng)。9.1.51.5mL離心管。9.1.60.2mLPCR薄壁管或八聯(lián)管。9.2試劑除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純。試驗(yàn)用水均符合GB/T6682-2008三級(jí)水規(guī)定。9.2.1細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，常溫條件下保存。9.2.2瓊脂糖（電泳級(jí)），2℃~8℃條件下保存。9.2.3DNA分子量標(biāo)記DL1000，-20℃保存。9.2.4陰性對(duì)照、陽性對(duì)照：陰性對(duì)照為滅菌超純水；陽性對(duì)照為滅活的溶血性曼氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株。9.2.5PCR擴(kuò)增用上、下游引物序列（見附錄B.3）。9.3細(xì)菌基因組DNA提取將初步鑒定為溶血性曼氏桿菌的菌株用商品化試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取。提取方法按試劑盒說明書進(jìn)行。9.4PCR擴(kuò)增每次進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，除檢測(cè)樣品外，均需設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。5PCR反應(yīng)體系：9.4.12×PCR反應(yīng)預(yù)混液12.5μL，模板DNA（空白對(duì)照用水代替）2μL，上下游引物各0.5μL，ddH2O補(bǔ)足至25μL。9.4.2PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s；50℃退火30s；72℃延伸40s；30個(gè)循環(huán)，72℃總延伸10min。9.5PCR產(chǎn)物電泳用1×TAE電泳緩沖液配制成2%瓊脂糖凝膠。取5μLPCR產(chǎn)物分別加入樣品孔，同時(shí)在一加樣孔中加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL1000），以5V/cm恒壓電泳，30min后采用凝膠成像系統(tǒng)判定核酸片段大小。9.6PCR結(jié)果判定9.6.1陽性對(duì)照出現(xiàn)一條230bp大小的條帶，且陰性對(duì)照不出現(xiàn)條帶。9.6.2在滿足9.6.1的條件下，被檢樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后出現(xiàn)一條230bp的條帶判定為核酸陽性（+）；被檢樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后不出現(xiàn)230bp的條帶判定為核酸陰性（-）。10間接ELISA抗體檢測(cè)10.1器材10.1.1酶標(biāo)儀。10.1.2洗板機(jī)。10.2試劑10.2.1包被抗原：大腸桿菌表達(dá)的溶血性曼氏桿菌LktA重組蛋白。10.2.2酶標(biāo)抗體：辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗綿羊二抗，兔抗牛二抗。10.2.3對(duì)照：Mh陽性血清、Mh陰性血清。10.2.4包被緩沖液（配制方法見A.4）。10.2.5封閉緩沖液（配制方法見A.5）。10.2.6洗滌緩沖液（配制方法見A.6）。10.2.7稀釋緩沖液（配制方法見A.7）。10.2.8TMB顯色液（配制方法見A.8）。10.2.9終止液（配制方法見A.9）。10.3檢測(cè)步驟10.3.1包被酶標(biāo)板Mh重組LktA蛋白用包被緩沖液稀釋至終濃度為0.5μg/mL，每孔100μL包被96孔酶標(biāo)板，4℃包被16h。用洗滌緩沖液洗板5次，每孔200μL，每次3min，洗滌結(jié)束后拍干。200μL/孔加入封閉緩沖液，37℃封閉2h，用洗滌緩沖液洗板5次后拍干。610.3.2ELISA操作步驟10.3.2.1酶標(biāo)板上對(duì)照和樣品的分布圖，見圖1。在A1孔和B1孔加入Mh陽性對(duì)照血清各100μL，在C1孔和D1孔加入Mh陰性對(duì)照血清各100μL；剩余孔加入待檢樣品血清100μL，每孔兩個(gè)平行，37℃孵育2h，洗板同上。10.3.2.2每孔加入100μL的酶標(biāo)抗體，37℃孵育45min，洗板同上。10.3.2.3每孔加入100μL的TMB顯色液，37℃避光孵育15min。10.3.2.4每孔加入50μL終止液終止顯色反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長處的OD值。123456789APS3BPS3CNS4DNS4ES1S5FS1S5GS2S6HS2S6說明：P—陽性血清對(duì)照孔；N—陰性血清對(duì)照孔；S1、S2、S3、S4等—待檢血清孔，以此類推。圖1樣品加樣記錄表（推薦模式）10.3.3試驗(yàn)成立條件陽性對(duì)照OD450＞1.5，且陰性對(duì)照OD450＜0.2，試驗(yàn)結(jié)果有效；否則，應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)。10.3.4結(jié)果判定在試驗(yàn)成立的前提下，待檢樣品OD450＞0.2，則判定該待檢樣品為Mh抗體陽性；待檢樣品OD450≤0.2，則判定該待檢樣品為Mh抗體陰性。11綜合判定11.1經(jīng)6.3判定為疑似Mh感染病例，經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)（見第8章）分離出溶血性曼氏桿菌，或經(jīng)PCR方法（見第9章）檢測(cè)出Mh核酸的，可判為溶血性曼氏桿菌感染。11.2臨床無明顯特異癥狀的非免疫動(dòng)物經(jīng)間接ELISA方法（見第10章）檢測(cè)出抗體陽性的，可判為該動(dòng)物曾經(jīng)疑似感染過Mh，需結(jié)合其他方法進(jìn)行綜合確診。11.3臨床無明顯特異癥狀的牛、羊，經(jīng)第8章、第9章、第10章中任意一項(xiàng)檢測(cè)出陽性的，可判為溶血性曼氏桿菌感染（潛伏感染或持續(xù)感染）。7（規(guī)范性）試劑的配制A.1胰蛋白胨大豆肉湯胰蛋白胨大豆蛋白胨氯化鈉磷酸氫二鉀葡萄糖2.5gpH7.3±0.2準(zhǔn)確稱取胰蛋白胨大豆肉湯（TrypticSoyBroth,TSB）30g，加熱攪拌溶解于1000mL蒸餾水中，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15分鐘，備用。A.20.01mol/LPBS溶液氯化鈉氯化鉀磷酸二氫鉀磷酸氫二鈉0.2g0.24g3.65gpH7.2將上述試劑加入到800mL蒸餾水中溶解，加水定容至1000mL，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15分鐘，室溫保存?zhèn)溆?。A.3胰蛋白胨大豆瓊脂胰蛋白胨大豆胨氯化鈉瓊脂5.0g5.0gpH7.3±0.2準(zhǔn)確稱取胰蛋白胨大豆瓊脂（TrypticSoyAgar,TSA）40g，加熱攪拌溶解于1000mL蒸餾水中，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15分鐘，充分混勻后倒平皿。A.4包被緩沖液（0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液）碳酸鈉碳酸氫鈉去離子水0.318g0.588g200mL用0.22μm濾膜過濾除菌，室溫保存?zhèn)溆?。A.5封閉緩沖液（含3%BSA的PBST）pH7.4PBS吐溫-20BSA現(xiàn)配現(xiàn)用。A.6洗滌緩沖液—PBSTpH7.4PBS吐溫-20現(xiàn)配現(xiàn)用。A.7稀釋緩沖液（含1%BSA的PBST）pH7.4PBS吐溫-20BSA現(xiàn)配現(xiàn)用。A.8TMB顯色液1000mL0.5mL1000mL0.5mL1000mL0.5mLA.8.1底物液ATMB（分析純）無水乙醇或DMSO蒸餾水A.8.2底物液B磷酸氫二鈉（分析純）檸檬酸（分析純）0.75%過氧化氫尿素蒸餾水200mg加至1000