DB36-T 1964-2024 新型冠狀病毒基因溯源技術規(guī)范

C05DB36Genetictraceabilitytechnicalspecificationfo江西省市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB36/T1964—2024 32規(guī)范性引用文件 33術語和定義 34樣本采集 35樣本運輸與管理 46全基因組測序 57序列生成 68結果解讀與溯源 6 7DB36/T1964—2024本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由江西省衛(wèi)生健康委員會提出。本文件由江西省衛(wèi)生健康標準化技術委員會（JX/TC037）歸口。本文件起草單位：江西省疾病預防控制中心。本文件主要起草人：施勇、李健雄、劉師文、肖芳、徐剛、冉鑫、肖大瑾、周珺、張艷妮、劉曉慶、吳楊博文、王倩、邱偉華、熊英。3DB36/T1964—2024新型冠狀病毒基因溯源技術規(guī)范本文件規(guī)定了新型冠狀病毒基因溯源的樣本采集、樣本運輸與管理、全基因組測序、序列生成、結果解讀與溯源等內容。本文件適用于承擔新型冠狀病毒基因溯源相關工作的機構開展基因溯源工作。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求WS233病原微生物實驗室生物安全通用準則WS/T776農貿(集貿)市場新型冠狀病毒環(huán)境監(jiān)測技術規(guī)范關于加強高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理的通知贛衛(wèi)科教發(fā)〔2009〕12號3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1新型冠狀病毒SARS-CoV-2引起新型冠狀病毒感染的病原體,為冠狀病毒屬的一個種。3.2全基因組測序wholegenomesequencing對生物樣本整個基因組序列進行測定，獲得完整的基因組信息。3.3基因溯源genetictraceability利用生物信息學的分析手段對生物樣本的基因組序列進行進化分析，獲得該生物樣本的系統(tǒng)進化關4樣本采集4DB36/T1964—20244.1樣本選取原則結合流行病學調查信息和病例傳播鏈關系，應選擇核酸檢測結果Ct值≤32且符合以下條件之一的樣本優(yōu)先開展測序：a)聚集性疫情的首代病例及流行病學關聯(lián)的關鍵病例；b)重癥和死亡病例；c)65歲以上年齡組病例和免疫功能低下人群；d)無基礎性疾病的16~60歲人群出現(xiàn)嚴重疾病的病例；e)新型冠狀病毒感染后臨床特征、流行特征發(fā)生異常變化的典型病例；f)輸入性病例、物品及相關環(huán)境陽性樣本。4.2樣本類型4.2.1病例應采集急性期呼吸道樣本，包括上呼吸道樣本（鼻咽拭子、口咽拭子等）或下呼吸道樣本（深咳痰液、肺泡灌洗液、支氣管灌洗液、呼吸道吸取物等），重癥病例宜優(yōu)先采集下呼吸道樣本。4.2.2環(huán)境樣本應采集物體表面樣本或污水樣本。4.3采集方法及要求4.3.1病例樣本采集可參照《江西省疾控機構新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊》第二版的相關要求進4.3.2同一病例應同時采集2份鼻咽拭子或口咽拭子放置在1個釆樣管內，以提高病毒載量用于病毒基因組測序。4.3.3環(huán)境樣本采集可參照WS/T776的相關要求進行。4.3.4宜采用非滅活病毒采樣管進行采樣。4.3.5采樣管應包裝完好，并在有效期內。5樣本運輸與管理5.1運輸要求5.1.1非滅活病毒采樣管采集的樣本屬于A類感染性物質，聯(lián)合國編號為UN2814，包裝參照世界衛(wèi)生組織《感染性物質運輸規(guī)章指導》的PI620分類包裝要求。5.1.2環(huán)境樣本屬于B類感染性物質，聯(lián)合國編號為UN3373，包裝參照世界衛(wèi)生組織《感染性物質運輸規(guī)章指導》的PI650分類包裝要求。5.1.3滅活病毒采樣管采集的樣本參照《關于進一步做好新冠病毒實驗室生物安全管理工作的通知》的要求，按照非感染性物質管理。5.1.4新型冠狀病毒潛在感染性物質運輸應按照《關于加強高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理的通知》要求，取得準運證書后，方可運輸。5.2樣本管理5.2.1新型冠狀病毒樣本檢測前應專人集中管理，準確記錄樣本的來源、種類、數(shù)量，編號登記、建立臺賬，采取有效措施確保樣本的安全，嚴防發(fā)生誤用、惡意使用、被盜、被搶、丟失、泄露等事件。5.2.2樣本應盡快進行檢測，24h內檢測的樣本可置于2℃~8℃保存；24h內無法檢測的樣本則應置于-70℃或以下保存(如無-70℃保存條件，則于2℃~8℃冰箱暫存，最長不超過72h)。5DB36/T1964—20246全基因組測序6.1實驗室生物安全及個人防護6.1.1實驗室應依據(jù)GB19489和WS233管理要求，確保實驗室生物安全和運行有效性。6.1.2實驗室人員應按照WS233的要求，根據(jù)所操作感染性物質的防護等級，選擇相適應的防護裝備進行防護。6.1.3可參照《關于進一步做好新冠病毒實驗室生物安全管理工作的通知》文件的要求，新型冠狀病毒培養(yǎng)、動物感染實驗應當在生物安全三級及以上實驗室開展；未經(jīng)培養(yǎng)的感染性物質、滅活物質的操作，應當在生物安全二級及以上實驗室進行，其中未經(jīng)95℃加熱15min滅活或固定的人體和動物組織樣本的操作應當在三級及以上實驗室開展；無感染性物質的操作可以在生物安全一級實驗室進行。6.2實驗準備6.2.1設備設備應包括但不限于核酸提取儀、PCR擴增儀、核酸定量儀、高通量測序儀及相應的輔助設備，設備應校準合格，并定期維護。6.2.2試劑試劑應包括但不限于核酸提取試劑盒、核酸定量試劑盒、新型冠狀病毒全基因組捕獲試劑盒、核酸純化磁珠、文庫制備試劑盒、高通量測序試劑盒，無水乙醇等，試劑應在有效期內使用。6.2.3耗材耗材應包括但不限于微量移液器、不同規(guī)格濾芯吸頭、磁力架、1.5mLEP管、0.2mLPCR管、96孔PCR板等，耗材應在有效期內使用。6.3基因測序6.3.1核酸提取病毒RNA提取宜使用核酸提取試劑盒，根據(jù)試劑盒說明書提取核酸。6.3.2靶向擴增應采用新型冠狀病毒全基因組捕獲試劑盒，并根據(jù)試劑盒說明書對新型冠狀病毒核酸進行靶向擴增。6.3.3擴增產物的純化應使用核酸純化磁珠對擴增產物進行純化。6.3.4純化產物的定量應使用核酸定量試劑盒對純化產物進行核酸定量。6.3.5文庫構建應根據(jù)使用的高通量測序儀選擇相匹配的文庫制備試劑盒進行文庫制備。6DB36/T1964—20246.3.6上機測序根據(jù)高通量測序試劑盒和高通量測序儀操作說明完成試劑裝載，設置測序參數(shù)進行測序。7序列生成7.1應去除測序數(shù)據(jù)中的PCR引物序列、接頭（adapter）和低質量的測序數(shù)據(jù)，引物序列按照最大引物長度30bp進行剪切（trim)。7.2應對下機數(shù)據(jù)進行質量控制（QC）分析，判斷測序質量是否達到儀器設備的QC值要求。7.3應以SARS-CoV-2參考基因組(GeneBank序列獲得號：NC_045512)為模板進行序列拼接，拼接之后對測序覆蓋度和測序深度進行分析，測序覆蓋度應≥96%，測序深度應≥100，最終生成一致性(consensus)序列，即為待溯源樣本的全基因組序列。8結果解讀與溯源8.1應將待溯源樣本的全基因組序列同SARS-CoV-2參考基因組(GeneBank序列獲得號：NC_045512)進行比對，分析出變異位點。8.2將待溯源樣本的全基因組序列同數(shù)據(jù)庫中的全基因組序列數(shù)據(jù)進行比對。8.3利用生物信息學分析工具對序列進行進化分析，獲得該序列的系統(tǒng)進化關系。8.4根據(jù)序列進化分析結果，結合流行病學調查信息，對該待溯源樣本進行綜合分析判斷，分析引起疫情的病毒來源，得出溯源結論。