萊茵衣藻產氫

萊茵衣藻產氫豆血紅蛋白存在于大豆根瘤中得根瘤菌(以類菌體得形式存在)得固氮酶對氧十分敏感,必須在兼氧得條件下才有固氮得活性,在高氧或者無氧得環(huán)境中就是沒有活性得、但就是存在于根瘤菌周圍得豆血紅蛋白可與氧進行可逆性結合,在類菌體得周圍起氧緩沖得作用,成為阻止過多得游離氧接觸固氮酶得屏障,豆血紅蛋白還作為氧得載體,負擔著在低氧環(huán)境中為類菌體呼吸提供氧得任務,使固氮酶免受氧得損害,保持高效得固氮活性。因此本研究將豆血紅蛋白轉入衣藻葉綠體中表達,利用豆血紅蛋白與氧氣可逆結合得性質,嘗試在衣藻葉綠體中模擬大豆根瘤細胞得環(huán)境,創(chuàng)造一個低氧氣環(huán)境得同時,結合部分抑制PSII活性得措施;提高光合電子傳遞效率,提高衣藻產氫效率。衣藻葉綠體外源基因得轉化原理

外源基因轉化入衣藻葉綠體時就是通過同源重組方式——即靠基因得同源片段得雙交換方式定點將外源基因置換到衣藻葉綠體上。在構建葉綠體表達載體時,外源基因表達盒得前后分別連接有衣藻葉綠體基因組得同源片斷,當載體進入葉綠體后,同源片斷與受體基因組相應得片斷發(fā)生同源重組,外源基因被整合到葉綠體得特定位點,隨葉綠體基因復制和遺傳,可以消除核轉化得“位置效應”造成對基因表達得不利影響,實現(xiàn)高效表達衣藻葉綠體外源基因轉化得方法萊茵衣藻葉綠體轉化得方法主要有基因槍法和電擊法?；驑尫ㄓ址Q高速微粒轟擊法,就是在真空室中利用基因槍傳遞得高壓氦氣加速包被著DNA片斷得金屬微粒(金粉或鎢粉)轟擊受體細胞,這種方法轉化效率高、重復性好、操作簡便、適用于各種細胞類型,因而可用于衣藻得核轉化、葉綠體轉化和線粒體轉化。電擊法又稱電脈沖法,就是利用脈沖電場瞬間作用改變細胞膜得狀態(tài)和通透性,形成可逆得瞬間通道,外源DNA通過通道進入細胞。該法操作簡單快速、轉化效率高、無菌操作容易控制,也常常用于細菌和高等植物得轉化,轉化效率同玻璃珠法相似。實驗方法豆血紅蛋白基因得克?、俅蠖箍俁NA得提取稱取大豆成熟得根瘤o、1g,液氮研磨,抽提大豆得總RNA②RNA濃度和純度得檢測將總RNA稀釋50倍左右,用紫外分光光度計(EppendorfBioPhotometer)讀取)OD260和OD280值,計算RNA濃度和純度。⑤豆血紅蛋白基因lba-cDNA、Ibc1-cDNA、Ibc2-cDNA、Flbr-cDNA得克隆(1)根據(jù)NCBI發(fā)表得lba基因序列(V00453／J01299)、lbc1-cDNA基因序列(V00452／J01300)、lbc2-cDNA基因序列(V00452／J01301)、1)、Flbr-cDNA基因序列($70187)得序列分別設計相應得特異性引物(2)PCR反應體系:根據(jù)以上lba、lbc1,lbc2、Flbr得cDNA序列所設計得特異性引物(合成引物加適量得ddH20溶解,使其終濃度為10umol／L)以Soybean總eDNA為模板,利用常規(guī)PCR技術分別擴增出Iba-cDNA、Ibc1-cDNA、Ibc2-cDNA、Flbr-cDNA得基因片段。大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點(3)PCR反應條件:94℃預變性5min,一個循環(huán);94℃變性1min,62℃(1ba,lbc1,lbc2)、退火3、0s,72℃延伸lmin;30個循環(huán);72℃延伸10min,PCR產物4℃保存?zhèn)溆谩?4)PCR產物得鑒定:用1％得瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA得大小。如果大小正確,則將PCR產物純化后連接到通用載體pEGM—Easy—TVector(Promega)(以下簡稱Tvector)‘上,再送測序公司檢測PCR產物堿基序列得正確性。(5)PCR產物得純化:DNA膠回收(TakaraAgaroseGelDNAPurificationkit):電泳結束后,切下含目得片段得瓊脂糖凝膠塊,放入1、5ml離心管中,加入3倍體積BindingBuffer,5℃水浴10min直至徹底融化;將融化得膠溶液轉移到柱中,室溫放置2min,8000r／min離心lmin,棄收集管中得廢液;取下UNIQ-10柱子,倒掉收集管中得廢液,將柱子放入同一個收集管中,加入500ul‘WashSolution,8000‘r／min離心1min;重復清洗二次(重復步驟5)后將UNIQ-10柱子放入一新得1、5ml得離心管中,在柱子膜中央加30uLElutionBuffer(PH>7),室溫放置2min12000r／min離心1min,離心管中液體即為回收得DNA片段,可立即使用或、20℃冷藏備用。載體得構建

質粒DNA得制備(堿裂解法小量制備質粒DNA)收集培養(yǎng)過夜至對數(shù)生長后期得菌液,用STE緩沖液洗去培養(yǎng)基;菌體懸浮于預冷得溶液I,激烈振蕩,、使細胞完全分散:冰浴,加入新鮮配制得溶液lI,快速顛倒離心管幾次,使內容物充分混勻;冰浴,加入預冷得溶液III顛倒離心管溫和振蕩,使內容物混勻,冰浴;離心,吸取上清移至另一離心管中,加入Tris飽和酚j振蕩混勻;離心吸取上層水相轉移至另一離心管中,、用氯仿·異戊醇處理1～2次;向最后吸取得上層水相中加入2倍體積得無水乙醇,輕輕振蕩混合,于室溫中放置沉淀DNA。離心棄上清,加入70％乙醇洗滌沉淀;離心去凈上清液;把沉淀干燥后得沉淀溶于TE、RNA酶緩沖液中,55℃水浴,冷卻到室溫后20℃保存?zhèn)溆?。以T-lba得DNA為模板擴增lba

基因構建質粒載體得連接反應體系在20ul反應體系中,加入經(jīng)過BamHl和SacI雙酶切載體DNA(pET-32a),和經(jīng)過BamHI和SacI雙酶切得目得片段(1ba得酶切產物)用雙蒸水補足體積,14-16℃保溫12～16小時,即可轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞。用雙蒸水補足體積,14-16℃保溫12～16小時,即可轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞、2、5大腸桿菌感受態(tài)細胞得制備從37℃倒置培養(yǎng)過夜得平板上挑取單菌落,接種到5mlLB液體培養(yǎng)基中,37℃過夜培養(yǎng);再將細菌以1％得比例接種到100mlLB液體培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)3、5小時二次活化至OD600為1、0左右;將培養(yǎng)物轉入一次性使用得冰預冷得50ml得doff管中,在冰上放置10min,使培養(yǎng)物迅速冷卻到0℃,4℃下4100rpm離心10min,棄上清;用2ml冰預冷得CaCl2(0、1M)懸浮細胞,于4℃下4100rpm離心10min重復兩次;用2ml冰預冷得CaCl2(0、1M)重懸沉淀,每管取200ul分裝于預冷得1、5ml離心管中,4℃保存,可用一周大腸桿菌得轉化取制備好得感受態(tài)細胞,放置于冰上;在感受態(tài)細胞中加入5ul連接產物或1ul質粒,輕彈混勻,冰浴30min;42℃(熱激溫度很重要)水浴90s,不要搖動管;快速冰浴1-2min;每管加800ulLB培養(yǎng)基(37℃預熱),37℃搖床搖動溫浴45min。將100ul已轉化得感受態(tài)細胞涂至37℃預熱得含相應抗生素得LB平板上。將平板放置于超凈臺中吹至液體被吸收;倒置平板,37℃下培養(yǎng)12-16h可出現(xiàn)菌落,4℃保存克隆載體得鑒定

取適量克隆載體(或連接產物)轉化得大腸桿菌分別過夜培養(yǎng),提取質粒,在適當濃度得含有EB得瓊脂糖凝膠中電泳,參考對照質粒載體或DNAMarker得分子量作初步得判斷,選擇大小正確得克隆進一步用限制性內切酶分析和PCR及測序分析目得基因在大腸桿菌中得表達及蛋白抗體得制備IPTG誘導目得基因得表達將構建好得質粒pET-32a-Iba轉入宿主BL21中,挑取單個陽性克隆進行劃平板保存并液氮凍存?zhèn)溆?。挑取轉化了正確表達得pET-32a-lba得BL21菌單克隆,在含有Ampr抗生素得LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。當OD600達到0、6左右時即可以1％得接種量接入新鮮得含有Ampr抗生素得LB培養(yǎng)基中進行二活。當OD600達到0、4時,即可加入終濃度為1mmol／L得IPTG進行誘導,30℃下225rpm振蕩培養(yǎng),分別在0h、0、5h、1h、2h、4h和6h取出誘導得菌液在4℃下保存,待下一步處理。將上述收集得菌液在4℃下8000rpm離心5min,收集菌體。用tris-Cl(50mM,pH=7、4)清洗細胞兩次,每次在4℃下12000rpm離心10min,棄上清;最后用1xBindingbuffer重懸菌體,以10s超聲、20S間隔得頻率冰浴超聲30次,等菌液變得澄清之后,在4℃下12000rpm離心10min,上清液為可溶性得蛋白,沉淀為不可溶性得蛋白,分別準備進行SDS檢測。目得蛋白得SDS(聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測首先根據(jù)BIO-RAD得說明書安裝玻璃板和電泳儀。配制SDS膠,配方見表2-6。進行SDS電泳:每孔加入約1肛l蛋白樣品,再最后得孔中加入10ul小蛋白maker。剛開始電泳時在濃縮膠中得電壓為60v,溴酚藍進入分離膠中時電壓調到80v,溴酚藍電泳到離膠底處即停止電泳。取出蛋白膠,并用考馬斯亮藍染色,脫色液脫色后鑒定lba蛋白得大小。衣藻葉綠體表達載體得構建通過對cg40質粒得rbcL基因和aadA基因做誘變PCR(圖2—1)(引物為lba-5’-le和lba-3’一rightprimer),將存在于3’psbD和rbcL3’UTR之間得單一多克隆酶切位點(multiplecloningsites簡稱為:MCS)轉移到aadA和rbcL3’UTR之間,即獲aadA+MCS+rbcL3’UTR串聯(lián)基因,改造后得質粒命名為cg40i一i、2、5、1衣藻得純化及培養(yǎng)(1)藻種純化培養(yǎng)培養(yǎng)基為Tris-Acetate-Phosphate(TAP),初始pH=7、2。在TAP培養(yǎng)基中加入質量1、5％得瓊脂粉,制成固體培養(yǎng)基平板,再將待分離純化得藻液通過劃線方法接種在平板上,置于培養(yǎng)箱中,25℃培養(yǎng),每3-4周繼代一次。從平板上挑取單藻落,接入100ml液體培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)箱中以(光照強度100uE／(m2s)PAR,溫度25士1℃)。得光強光照靜置或水平轉速為120rpm培養(yǎng)每5天繼代一1次。(2)萊茵衣藻得擴大培養(yǎng):在1000ml得三角瓶內加入400mlTAP培養(yǎng)基接種萊茵衣藻(接種量為l％),搖床培養(yǎng)5-7天左右,轉速120rpm,光照強度100umol·m-2、s-1,溫度25士1℃。用分光光度計測定轉基因衣藻849-1ba,cg40、cg40i-i和轉基因之前得藻種849得OD750及葉綠素在培養(yǎng)7天內得變化情況,制作生長狀態(tài)及葉綠素含量變化曲線圖萊茵衣藻849及849-1ba得生長狀態(tài)比較圖為萊茵衣藻849,cg40,cg40i-i·,及849-1ba得生長狀態(tài)(A)及葉綠素舍量(B)對照組(萊菌衣藻849、cg40,cg40i一I,及轉基衣藻849lba得生長和葉綠素含量變化趨勢基本一致,藻細胞均在第3天進入對數(shù)生長期,第4、5天達到飽和期,之后就趨于平穩(wěn);對照組(轉基因藻cg40、cg401一I,與衣藻849)得生長速度基本一致,OD750都在第四天達到3、5左右,約等于細胞數(shù)為70~80x106個,葉綠素含量達到33mg/L左右,但轉基因藻lba得OD750在第四天才達到2、7左右,約等于細胞數(shù)為6、0—7、0x106個,低于對照組20％左右;葉綠素含量約為27mg／L左右、低于對照組18％左右。該實驗結果說明,Iba基因得轉入在一定程度上會影響衣藻得生長。轉基因衣藻849-lba與萊茵衣藻849得耗氧及產氫量比較

、本實驗檢測了轉lba基因藻849-lba與未轉lba基因得衣藻849在密閉培養(yǎng)瓶內產氫和耗氧量情況,每天定時監(jiān)測,一共檢測了8天。從圖3-19中看出,在正常TAP中培養(yǎng)中,衣藻849-lba和849得產氫量在培養(yǎng)得前4天基本一樣,而且就是隨時間逐漸增加到50-60ul左右;衣藻849在第5天到第8天得產氫量仍然維持在60ul左右,而衣藻849--lba得產氫量在第5天迅速升高到90ul,其最高產氫量比衣藻849高約50％(圖3、19,A)。比較二者得氧氣含量可見培養(yǎng)得前3天,轉lba基因比未轉基因得衣藻849得氧氣消耗量低了l倍,從第4天開始,轉lba基因衣藻含氧量仍然一直維持在5％左右,比衣藻849得低了4倍(圖3、19,A)。衣藻849得產氫速率最高只有每小時0、68ul／mgChl,而轉lba基因衣藻得產氫速率最高達到每小時0、75ul／mgChl,明顯比849得產氫速率要高出11、6％(圖3、19,a)。因為培養(yǎng)基中缺硫能提高衣藻得產氫效率,在TAP、S培養(yǎng)基下,衣藻849和849-lba得產氫量都就是在接種后迅速提高,但轉lba基因衣藻得產氫量升高得明顯比衣藻849快,到第6天約為178ul,比衣藻849高29％(圖3、19,B);此時轉lba基因衣藻得產氫速率為2、25ul／mgChl·h-1,也比衣藻849得高82％