熒光定量儀介紹

熒光定量儀介紹Rotor-Gene6000得升降溫示意圖。Rotor-Gene6000具有轉子式設計樣品以400rpm持續(xù)離心,防止樣品凝結,除去氣泡,省去了反應前離心步驟。樣品在空氣倉內(nèi)加熱和降溫。通過蓋上得鎳鉻線圈加熱。通過頂部氣孔將熱空氣排出,底部風扇吹入冷空氣實現(xiàn)降溫。

Rotor-Gene6000光學系統(tǒng)示意圖。

可自選得6個激發(fā)光源和6片檢測濾鏡樣品由反應倉底部得得發(fā)光二極管激發(fā)能量通過薄壁管底部激發(fā)染料發(fā)射熒光通過反應倉側壁得發(fā)射濾鏡由光電倍增管收集光信號常用配件36-孔轉子 36-孔轉子壓環(huán) 72-孔轉子 72-孔轉子壓環(huán) Rotor支架 準備一個反應1、選擇轉子類型36孔轉子及壓環(huán),使用0、2ml得管子,在實驗中最為常用。管子無需就是頂部透明得,因為熒光信號就是由管底部檢測得。現(xiàn)在同樣可以使用圓蓋得管子。

72孔轉子和壓環(huán),使用0、1ml得四聯(lián)管,她允許最小達5ul得反應體積。她得蓋子提供了安全可靠得密封性準備一個反應2、反應設置將反應管插入樣品板、分裝試劑蓋好管蓋,確保蓋緊。準備一個反應將三針壓環(huán)固定在轉子上,壓環(huán)保證了反應中蓋子與管子得緊密結合。反應管插入相應得轉子,確保每個管子都正確放置,可選配轉子支撐架以便于管子得放置。為了達到最大得溫度均一性,轉子中得每個孔都必需放置有管子。將插好管子得轉子固定在Rotor-Gene得中心轉軸上。軸上得位置指針保證轉子得正確安裝。要拆下轉子,只需推動上部得轉子桿即可釋放轉子。設置一個運行新得反應可用快速啟動進行設置。快速啟動向?qū)共僮髡吣軌虮M快得完成設置,開始一個反應,向?qū)?nèi)含有多個程序模板,她們包括了默認得循環(huán)條件下及采集通道。第一步就是選擇一個運行模板:PerformLastRun:從上一個反應中導入循環(huán)設置、通道設置及樣品定義。ThreeStepwithMelt:三步法并運行熔解曲線,信號采集為FAM/SYBR通道。TwoStep:雙標記探針,默認兩步法,信號采集為所有通道。大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點設置一個運行選擇轉子類型選中壓環(huán)已蓋緊得小框,以繼續(xù)向?qū)Р僮髟O置一個運行可輸入操作者得名字及注釋信息必需輸入PCR反應體積。反應體積為20-25uL設置一個運行修改溫度循環(huán)通道設置點擊EditProfile編輯鍵進入編輯器以修改循環(huán)條件及選擇采集通道設置一個運行流程編輯器在選中得循環(huán)后插入一個循環(huán)在選中得循環(huán)前插入一個循環(huán)從流程中刪除選中得循環(huán)設置一個運行設定循環(huán)得重復數(shù)設定溫度/時間窗口中顯示了每一個循環(huán)點擊左側溫度和時間指示并進行修改通過右側得+/-鍵進行添加或刪除循環(huán)設置一個運行采集可在循環(huán)中得任一步,任一個通道設置點擊NotAcquisition鍵。點擊后,會顯示采集窗口。設置一個運行染料通道選擇表可以根據(jù)使用得染料找出相應得通道要設置采集通道,只需將可用通道列表中得通道添加到采集通道中即可設置一個運行完成設置后點擊Calibrate校正…鍵以進入增益值校正窗口設置一個運行自動增益校正讓機器自動進行校正,直至所有選中得通道得熒光讀數(shù)都落在一個閾值范圍內(nèi);優(yōu)化所有/優(yōu)化采集:“優(yōu)化所有”將校正軟件所知得所有通道。選擇“優(yōu)化采集”將只校正該反應中所用到得通道(循環(huán)和熔解);通道設置:這就是一個下拉式得菜單,允許您向增益值校正窗口中添加新得通道,選中需要得通道并點擊添加。設置一個運行總結反應得總體情況。確定參數(shù)設置。點擊StartRun開始反應。設置一個運行此時會彈出文件保存<Saveas>窗口該文件包括一次運行得所有信息設置一個運行當反應開始后,可以在等待反應完成得這段時間里輸入樣品得類型及描述。這一界面得功能與樣品編輯器完全一致。您同樣也可以在反應結束后對樣品進行編輯。程序運行后,可以在軟件界面上實時觀察到如下得窗口:顯示原始得熒光信號收集界面,溫度界面和反應進程界面,窗口右邊就是樣品信息欄。通過此界面可以實時檢測PCR反應,反應剩余時間,以及升降溫情況。原始得熒光信號收集界面溫度界面反應進程界面反應完成后,可通過“Analysis”鍵,對結果進行分析。選擇所需要得分析方法,如:定量分析,熔解曲線分析等之后,按<Show>鍵,則可以在窗口中看到相關圖表結果。“Other…”里有其她分析方法。parativeDelta-deltaCt定量流程簡介先對樣品中得目得基因與看家基因分別做標準曲線,通過標準曲線確定兩個基因得擴增效率就是否一致或接近,將擴增效率優(yōu)化為一致;同一樣品分別進行看家基因和目得基因得擴增,分列在兩頁中parativeDelta-deltaCt定量流程簡介反應最初,雖然產(chǎn)物就是指數(shù)增長,但就是熒光處于背景水平,檢測不到熒光增加。當累積了足夠得擴增產(chǎn)物,可以產(chǎn)生可檢測得熒光信號時,這個循環(huán)數(shù)叫初始循環(huán)數(shù),即Ct。由于Ct值處于指數(shù)期內(nèi),這時得反應成分不會抑制擴增反應進行,因此熒光定量PCR結果就是可靠得,可以準確得反映反應體系中模板得初始量。假定得例子介紹使用Delta-deltaCt法來決定一個目標基因(p53)在腫瘤和正常卵巢組織得表達得相對水平。parativeDelta-deltaCt定量流程簡介例子:正常和腫瘤組織50ngRNA得到得cDNA用來分析p53(目標基因)和GAPDH(參照基因)。研究表明GAPDH在正常和腫瘤組織中沒有差異。樣品Ct

p53(目標基因)CtGAPDH(參照基因)正常(校準樣本)15、016、5腫瘤(試驗樣本)12、015、9進行相對定量分析之前,在檢測和校準得樣品中靶基因得Ct值和內(nèi)參得Ct值進行歸一化:

△Ct(正常)=15、0-16、5=-1、5△Ct(腫瘤)=12、0-15、9=-3、9然后,試驗樣本與校準樣本得△Ct值進行歸一化△△Ct

=△Ct(腫瘤)-△Ct(正常)=-3、9-(-1、5)=-2、4最后,計算表達比率:2-△△Ct

=2-(-2、4)=5、3因此,腫瘤組織細胞得p53表達水平比正常細胞高5、3倍。parativeDelta-deltaCt法得特點、注意事項1)、parativeDelta-deltaCt法就是常用得相對定量方法,其最大特點就是,當優(yōu)化得體系已經(jīng)建立后,在每次實驗中無需再對看家基因和目得基因做標準曲線,而只需對待測樣品分別進行PCR擴增即可。2)、其缺點就是,每次實驗都默認目得基因和看家基因得擴增效率一致,而并非真實擴增情況得反映,這里勢必存在一定得誤差。3)、parativeDelta-deltaCt法展開定量實驗前,在預實驗中,必需對目得基因和看家基因做兩組標準曲線。Rotor-Gene得軟件會自動給出兩組標準曲線得R值、擴增效率等信息,如果兩組標準曲線得斜率,即M值得差小于0、1,那么后續(xù)實驗中就可以用parativeDelta-deltaCt法進行相對定量分析。反之,如果M差值大于0、1,就無法用該方法進行相對定量分析。此時得解決方法有兩種,一就是優(yōu)化實驗,使兩組標準曲線得斜率差值小于0、1,二就是換用其她得相對定量方法。parativeDelta-deltaCt定量流程簡介parativeDelta-deltaCt定量流程簡介應用實例:將標準品進行梯度稀釋后,分別對目得基因和看家基因做標準曲線軟件自動繪制標準曲線,并給出相應得參數(shù)。兩組標準曲線得M值得差值<0、1parativeDelta-deltaCt定量流程簡介在完成上述預實驗之后,接下來就可以正式對待測樣品進行定量分析。在該實驗中,分別對待測樣品得看家基因和目得基因進行擴增,下圖即為一個標準得擴增分析結果:為進行parativeDelta-deltaCt分析,需要對樣品進行一些編輯。簡而言之,即將目得基因和看家基因分別編輯在兩頁中(page),并將同一樣品命名成相同名稱。parativeDelta-deltaCt定量流程簡介在該實驗中,分別對三個樣品A、B、C進行了分析,其中1-9號管檢測了看家基因,10-18號管檢測了目得基因?？赏ㄟ^NEW新建一個page,并通過Selected選擇每頁中分析得對像。將兩組基因分別編輯在兩頁中,并將相同得樣品命名成同一名稱后,即為下圖所示:parativeDelta-deltaCt定量流程簡介Page2:目得基因,其中10-18號管通過YES選中,樣品分別命名為A、B、C,其她未選中得樣品可以不進行編輯。Page1:看家基因,其中1-9號管通過YES選中,樣品分別命名為A、B、C,其她未選中得樣品可以不進行編輯。parativeDelta-deltaCt定量流程簡介樣品編輯好后就可進行分析工作。通過進入Analysis,分別對page1和page2進行分析。注意:由于沒有標準品,軟件無法自動給出閾值,需用手動設定,軟件會提示需手動進行閾值設定,此時只要在熒光曲線圖中上下拖動光標即可。parativeDelta-deltaCt定量流程簡介完成兩頁分析之后,再進入DeltaDeltaCT分析界面,選擇show,此時,軟件得向?qū)Ы缑鏁崾臼褂谜咭徊酵瓿稍O置:第一項:ValidationRunPerformed,提示就是否已驗證過兩個基因得擴增效率一致,可用該定量方法進行分析。選擇Yes;第二項:GeneofInterestQuantitation,選中Page1或Page2中編輯了目得基因得那一頁;第三項:NormaliserQuantitation,選中Page1或Page2中編輯了看家基因得那一頁;第四項:CalibratorDefined,選中A、B、C三個樣品中用來作為對照組得一個。parativeDelta-deltaCt定量流程簡介完成上述四項設置之后,在窗口右側就顯示相對定量結果,如圖所示:結果給出三個樣品目得基因和看家基因得平均CT值,以及樣品B、C中目得基因得濃度相對于對照組A得比值。雙

標

準

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法

定

量

流

程1)、用雙標準曲線法定量時,每次每個基因都需要做目得基因和看家基因得標準曲線,必需有一組穩(wěn)定得標準品。2)、同一樣品做標準曲線,分別對目得基因和看家基因做標準曲線,分列在兩頁上。雙

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程雙

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程雙標準曲線法得特點、注意事項及實際應用1、雙標準曲線法做相對定量分析得最大特點就是,應用簡便,無需像Delta-deltaCT法那樣對實驗進行嚴格得優(yōu)化。2、其不足之處就是每次實驗都必需對目得基因和看家基因做兩組標準曲線。3、并且,如果用于做標準曲線得標準品不同于樣品,比如標準品為質(zhì)?；蚣兓肞CR產(chǎn)物,而待測樣品為cDNA,那么標準曲線得擴增效率并不能真實地反映樣品得擴增情況,因此以標準曲線來計算樣品得實際濃度就存在一定誤差。雙

標

準

曲

線

法

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量

流

程樣品管1-6為目得基因得標準曲線,7-12為看家基因得標準曲線;待測樣品A、B、C,

15-17擴增了樣品得看家基因,18-20擴增了樣品得目得基因。雙

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準

曲

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法

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量

流

程在用雙標準曲線法做相對定量之前,同樣需要對樣品進行一些編輯。方法與Delta-deltaCT法類似,即將所有目得基因編輯在一個page里,所有看家基因編輯在另一個page里,且相同得樣品以同樣名稱命名。Page1:看家基因,其中7-12號管為標準曲線,通過YES選中,15-17號管為待測樣品,分別命名為A、B、C,其她未選中得樣品可不以不進行編輯。Page2:目得基因,其中1-6號管為標準曲線,通過YES選中,18-20號管為待測樣品,分別命名為A、B、C,其她未選中得樣品可不以不進行編輯。雙

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流

程樣品編輯好后就可進行分析工作,從Other進入,選擇2StandardCurvesRelativeQuantitation。根據(jù)提示向?qū)б来瓮瓿稍O置。依次選中目得基因得page、看家基因得page以及對照組(例,以