微生物限度檢查法培訓(xùn)資料

非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法內(nèi)容11106非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法21107非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)3培訓(xùn)內(nèi)容1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查——微生物計(jì)數(shù)法培訓(xùn)內(nèi)容定義微生物計(jì)數(shù)法系用于能在有氧條件下生長嗜溫細(xì)菌和真菌計(jì)數(shù)。微生物計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)環(huán)境應(yīng)符合微生物限度檢查的要求。檢驗(yàn)全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。潔凈空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定時進(jìn)行檢測。試驗(yàn)環(huán)境9203藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則微生物限度檢查應(yīng)在不低于D級背景下的生物安全柜或B級結(jié)凈區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)環(huán)境9205藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室微生物監(jiān)測和控制指導(dǎo)原則日常監(jiān)測：壓差：潔凈區(qū)與非潔凈區(qū)之間壓差不小于10Pa

不同級別潔凈區(qū)之間的壓差不小于10Pa

潔凈區(qū)各房間之間的壓差不小于5Pa溫度：18~26℃相對濕度：45%~65%試驗(yàn)環(huán)境9205藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室微生物監(jiān)測和控制指導(dǎo)原則定期監(jiān)測-物理參數(shù)/非生物活性的空氣懸浮粒子/有生物活性的微生物監(jiān)測監(jiān)測頻次及項(xiàng)目C級-沉降菌、浮游菌、表面微生物-季度/次，空氣懸浮粒子-半年/次A級-沉降菌、表面微生物-每次試驗(yàn)，浮游菌-月/次試驗(yàn)環(huán)境計(jì)數(shù)方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數(shù)法（MPN法）。MPN法用于微生物計(jì)數(shù)時精確度較差，但對于某些微生物污染量很小的供試品，MPN法可能是更合適的方法。供試品檢查時，應(yīng)根據(jù)供試品的理化特征和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選擇計(jì)數(shù)方法，檢測樣品量應(yīng)能保證所獲得的試驗(yàn)結(jié)果能夠判斷供試品是否符合規(guī)定。所選方法的適用性須經(jīng)確認(rèn)。計(jì)數(shù)方法檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用到的供試品。（g/ml/cm2）一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于2個最小包裝的供試品，混合，取規(guī)定量供試品進(jìn)行檢驗(yàn)。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10ml；膜劑/貼劑和貼膏劑為100cm2。貴重藥品/微量包裝的檢驗(yàn)量可以酌減。檢驗(yàn)量計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查供試品微生物計(jì)數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。供試品計(jì)數(shù)方法適用性檢查供試品的微生物計(jì)數(shù)方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，已確認(rèn)所采用的方法適合該產(chǎn)品的微生物計(jì)數(shù)。若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響結(jié)果時，計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新進(jìn)行適用性試驗(yàn)。適用性檢查胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）微生物計(jì)數(shù)法試驗(yàn)用培養(yǎng)基金黃色葡萄球菌

CMCC（B）26003

銅綠假單胞菌

CMCC（B）10104枯草芽孢桿菌

CMCC（B）63501白色念珠菌

CMCC（F）98001

黑

曲

霉

CMCC（F）98003試驗(yàn)菌種試驗(yàn)用菌株傳代次數(shù)不得超過5代。獲得標(biāo)準(zhǔn)菌株（以凍干粉0代為例）復(fù)溶菌粉，取1ml菌液加入TSB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時（菌種復(fù)蘇）準(zhǔn)備保存菌種（取上述TSB培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)接到新的TSB或者TSA平板/斜面中培養(yǎng)24小時）使用甘油或者磁珠保存法，將菌種分裝到冷凍保藏管，保藏于-30℃以下準(zhǔn)備工作菌種（取冷凍保藏管中的菌，轉(zhuǎn)接到新鮮的TSA斜面上，培養(yǎng)24小時，斜面可于2~8℃保藏取斜面上的菌，轉(zhuǎn)接到TSB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時菌種傳代金葡、銅綠、枯草白念黑曲霉菌液制備TSB/TSASDA/SDBSDA/PDApH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉含0.05%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液或含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用；若保存在2~8℃，可在24小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2~8℃，在驗(yàn)證的貯存期內(nèi)使用。30~35℃18-24h20~25℃3-5d20~25℃5-7d菌種及菌液制備需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)金葡、銅綠、枯草、白念、黑曲霉白念、黑曲霉TSATSASDASDA固體培養(yǎng)基：試驗(yàn)組培養(yǎng)基菌落數(shù)對照組培養(yǎng)基菌落數(shù)=0.5~2菌落形態(tài)一致30-35oC，不超過3天，白念、黑曲不超過5天20-25oC，不超過5天試驗(yàn)組試驗(yàn)組對照組對照組微生物計(jì)數(shù)法：培養(yǎng)基適用性檢查取供試品，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或pH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或其他稀釋液配置成1：10供試液，根據(jù)產(chǎn)品需要取更高稀釋級或可加入無菌表面活性劑、中和劑、滅活劑或加熱處理（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定）若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至6~8，必要時，可進(jìn)一步10倍系列稀釋傾注法薄膜過濾法涂布法MPN法微生物計(jì)數(shù)法-供試液制備pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液0.9%氯化鈉溶液胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基pH6.8磷酸鹽緩沖液pH7.2磷酸鹽緩沖液pH7.6磷酸鹽緩沖液稀釋液取1ml供試液置90mm平皿中注入15~20ml溫度不超過45oC的TSA或SDA，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)點(diǎn)計(jì)平板上生長的菌落數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，計(jì)算1g、1ml或10cm2供試品的菌落數(shù)，取兩位有效數(shù)字報(bào)告微生物計(jì)數(shù)法-傾注法取15~20ml溫度不超過45oC的TSA或SDA，注入90mm平皿，凝固，制成平皿將供試液接種至平板（供試液不少于0.1ml）點(diǎn)計(jì)平板上生長的菌落數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，計(jì)算1g、1ml或10cm2供試品的菌落數(shù)，取兩位有效數(shù)字報(bào)告微生物計(jì)數(shù)法-涂布法取相當(dāng)于1g、1ml或10cm2供試品的供試液必要時，用同一種稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋過濾，沖洗，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于TSA或SDA上，倒置，培養(yǎng)以相當(dāng)于1g、1ml或10cm2供試品的菌落數(shù)報(bào)告微生物計(jì)數(shù)法-薄膜過濾法取1ml3個連續(xù)稀釋級的供試液每一稀釋級取3份接種至裝有9~10mlTSB中，30~35℃培養(yǎng)不超過3天記錄每一稀釋級別微生物生長管數(shù)，查MPN表，報(bào)告每1g或1ml供試品中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)微生物計(jì)數(shù)法-MPN法需氧菌總數(shù)指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包括真菌菌落數(shù)）；霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上的總菌落數(shù)（包括細(xì)菌菌落數(shù)）若因沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌使霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或者其他選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測定各品種項(xiàng)下規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)解釋如下：101cfu:可接受的最大菌數(shù)為20；102cfu:可接受的最大菌數(shù)為200；103cfu:可接受的最大菌數(shù)為2000；依此類推。微生物計(jì)數(shù)法-結(jié)果判斷1106非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查——控制菌檢查法培訓(xùn)內(nèi)容培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查控制菌檢查方法適用性流程大腸埃希菌檢查法鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤耐膽鹽革蘭氏陰性菌檢查法耐膽鹽革蘭氏陰性菌取供試品，用TSB作為稀釋液制備1：10的供試液，混勻，在20~25℃培養(yǎng)約2h取相當(dāng)于1g或者1ml供試品的上述預(yù)培養(yǎng)物1ml接種至適宜的EE肉湯取相當(dāng)于0.1g、0.01g和0.001g（或0.1ml、0.01ml、0.001ml）試品的上述預(yù)培養(yǎng)物或稀釋液分別接種至適宜體積的EE肉湯中上述培養(yǎng)物劃線至VRBG上定性試驗(yàn)定量試驗(yàn)30~35oC，培養(yǎng)24~48h30~35oC，培養(yǎng)18~24hVRBG上是否有菌生長革蘭氏染色是否為陰性？是未檢出是檢出否否上述培養(yǎng)物劃線至VRBG上30~35oC，培養(yǎng)24~48h30~35oC，培養(yǎng)18~24hVRBG上是否有菌生長革蘭氏染色是否為陰性？是是陽性陰性否根據(jù)陰性或陽性結(jié)果查表，得到可能菌數(shù)（N）是否是1:10TSB（20~25oC2h）1：1001：1000pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（+）（+）1239ml9ml1ml1ml各1ml（—）1：10<100cfu大腸1：10<100cfu銅綠1：101：1001：10001ml1ml1ml稀釋劑腸道菌增菌液體培養(yǎng)基30~35oC,24~48h耐膽鹽革蘭陰性菌檢查（定量試驗(yàn)）耐膽鹽革蘭氏陰性菌結(jié)果判斷沙門菌檢查法有些菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心。金黃色葡萄球菌檢查法呈黃色菌落,或外周有黃色環(huán)的白色菌落銅綠假單胞菌檢查法黃綠色扁平濕潤白色念珠菌檢查法乳白色偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時間稍久則菌落增大，顏色變濃，質(zhì)地變硬或有褶皺1107非無菌藥品微生物標(biāo)準(zhǔn)培訓(xùn)內(nèi)容1107非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)Eg1：聚乙二醇4000散——質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)-微生物限度需氧菌總數(shù)：不得過103cfu/g霉菌及酵母菌總數(shù)：不得過102cfu/g大腸埃希菌：不得檢出Eg2：克霉唑陰道片——質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)-微生物限度需氧菌總數(shù)：不得過102cfu/g霉菌及酵母菌總數(shù)：不得過101cfu/g金黃色葡萄球菌：不得檢出銅綠假單胞菌：不得檢出白色念珠菌：不得檢出1107非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)1107非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)Eg3：健胃消食片——質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)-微生物限度需氧菌總數(shù)：不得過104cfu/g