葡萄糖-6-磷酸脫氫酶檢測試劑概述

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶檢測試劑概述（原創(chuàng)2022-05-19CMDE中國器審）

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphatedehydrogenase,G6PD）廣泛存在于各種生物體內(nèi)，它是糖酵解磷酸戊糖旁路中的一個關鍵酶和限速酶，其主要的功能是產(chǎn)生NADPH。NADPH對于維持細胞的正常生理功能和形態(tài)具有極為重要的作用。當其缺乏時，紅細胞極易受到氧化損傷，出現(xiàn)溶血性疾病，表現(xiàn)為黃疸甚至出現(xiàn)核黃疸。蠶豆病是葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥患者在進食蠶豆或蠶豆制品后所引發(fā)的急性血管內(nèi)溶血性貧血，臨床表現(xiàn)為皮膚、鞏膜黃染，有些病例出現(xiàn)血紅蛋白尿，有些則有肝腫大現(xiàn)象。蠶豆病多發(fā)于幼兒及兒童，以男性多見。G6PD基因突變是導致該基因缺乏的主要原因，G6PD基因定位于Xq28，由13個外顯子和12個內(nèi)含子組成，編碼515個氨基酸。G6PD缺乏癥屬于X連鎖不完全顯性遺傳，早期的診斷和預防具有重大意義。

一、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶常用檢測方法

目前，G6PD常用檢測方法包括酶學和基因檢測兩大類，酶學檢測法包括葡萄糖-6-磷酸底物法、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶G6PD/6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-phosphogluconatedehydrogenase6PGD)比值法、高鐵血紅蛋白還原法、熒光斑點法等；常規(guī)基因檢測法包括等位基因特異性擴增(ARMS)、等位基因寡核苷酸探針雜交(ASO)、錯配堿基聚合酶鏈反應/限制性內(nèi)切酶圖譜分析等。

二、目前已批準葡萄糖-6-磷酸脫氫酶產(chǎn)品概況

目前已上市葡萄糖-6-磷酸脫氫酶檢測產(chǎn)品包括檢測葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變情況的基因檢測法以及檢測葡萄糖-6-磷酸脫氫酶含量及活性的酶學檢測法。樣本類型包括血清、全血、新生兒足跟血濾紙干血片等多種類型。

1.基因檢測方法

已上市基因檢測產(chǎn)品的方法學包括熒光PCR熔解曲線法、PCR-反向點雜交法等，用于體外定性檢測人外周血基因組DNA中的中國人群常見的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變。

2.酶學檢測方法

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶酶活性檢測方法具有操作簡單、方便快捷、價格低廉等諸多優(yōu)點，已在臨床診斷中被廣泛應用。已上市酶學檢測產(chǎn)品的方法學多為葡萄糖-6-磷酸底物法。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶在NADP（氧化型輔酶Ⅱ）存在條件下催化6-磷酸葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖醛酸和NADPH（還原型輔酶Ⅱ）。在340nm處測定NADPH的生成速率，即可檢測葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性。此外還有比值法檢測試劑，試劑A液用于檢測G6PD活性，B液用于檢測6PGD活性，兩者分別在不同的通道內(nèi)檢測，采用速率法分別檢測紅細胞中G6PD與6PGD的活性，反應原理均為催化其相應的底物反應，同時將NADP還原為NADPH，通過監(jiān)測340nm處吸光度上升的速率即可計算兩者的活性，再計算兩者的比值，進而判斷G6PD是否缺乏。

三、國際葡萄糖-6-磷酸脫氫酶檢測試劑監(jiān)管概況

WHO于2016年10月發(fā)布了《葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性檢測體外診斷試劑指導原則》，該指南根據(jù)性別和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性將人群劃分為正常、缺陷和中介（如表1）。現(xiàn)將該指南對分析性能評估的要求概述如下。表1

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性劃分1.適用樣本類型

（1）證明樣本類型的等效性

至少選用25個葡萄糖-6-磷酸脫氫酶正常樣本、25個中介樣本和25個缺陷樣本，證明每種聲稱樣本類型的等效性。

（2）證明聲稱抗凝劑的等效性

至少選用25個葡萄糖-6-磷酸脫氫酶正常樣本、25個中介樣本和25個缺陷樣本，證明每種聲稱抗凝劑的等效性。

2.樣本收集、儲存和運輸

樣本穩(wěn)定性研究應考慮到儲存條件（不同溫度下的持續(xù)時間、濕度變化、溫度限制、凍融循環(huán)），運輸條件（如適用），樣本采集和/或轉移裝置（包括干血斑濾紙）是否含有抗凝劑、是否可以密封。

3.精密度

重復性和再現(xiàn)性試驗都應根據(jù)預期用途選用至少1個葡萄糖-6-磷酸脫氫酶正常樣本、1個中介樣本和1個缺陷樣本。所選樣本應確保在關鍵決策點附近、具有良好的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性代表性。必須證明關鍵決策點附近樣本的精密度。每個測試樣本應采用三批試劑，進行5個重復，運行3-5次，選擇3個不同的試驗地點，酶學方法還應選用2個溫度。

4.分析靈敏度

（1）最低檢出限

選擇至少8個樣本進行最低檢出限研究，每個濃度至少檢測15次。將95%檢出率的最低酶活性作為最低檢出限。所檢測樣本的酶活性應采用合適的生物學參考物質以及合適的參考方法進行校正。

（2）關鍵決策點性能驗證

必須驗證試劑區(qū)分葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的能力（如正常、缺陷、中介）。

可以采用不同比例混合葡萄糖-6-磷酸脫氫酶正常和缺陷樣本來實現(xiàn)，獲得廣泛的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性，從而了解決策點（即缺陷/中介/正常）的性能。應測試至少三對單獨試樣的混合物。

（3）測量范圍和相關性

定量檢測試劑必須采用經(jīng)合適生物學參考物質以及合適參考方法進行校正的、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性已知的樣本進行測量范圍研究。對已知G6PD活性樣本的平行試驗結果進行適當?shù)慕y(tǒng)計分析，還應確定定量與適當參考試驗的相關性程度。

對于報告血紅蛋白濃度或將血紅蛋白濃度標準化作為報告結果的一部分的試劑，還必須確定測定血紅蛋白濃度的定量測量范圍和相關程度。

5.分析特異性

特異性研究必須研究假正常或假缺陷結果的可能性，研究可采用自然或人工樣本進行。內(nèi)源性干擾物質包括：總膽固醇，血脂、膽紅素和蛋白質升高樣本，乳酸，乳酸脫氫酶，含銅化合物如氯化銅、硫酸銅，異常高值（54-65%）和異常低值（17-18%），血球壓積，網(wǎng)織紅細胞，白細胞和血小板升高樣本，瘧疾，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎，艾滋病毒，肺炎，傷寒，鐮狀細胞貧血，變異血紅蛋白（A、D、E、S、C），貧血，血紅蛋白病，缺鐵，白血病和/或其他紅細胞疾病，糖尿病。外源性干擾物質包括相關藥物，如抗寄生蟲、抗瘧疾、抗逆轉錄病毒和抗結核藥物、普通非處方抗炎藥物（阿司匹林、撲熱息痛、布洛芬）、乙醇、咖啡因和某些類固醇（醛固酮相關）。

四、對我國葡萄糖-6-磷酸脫氫酶檢測試劑審評的思考

目前已有相關產(chǎn)品在國內(nèi)上市，部分處于研發(fā)或計劃申報階段。此類產(chǎn)品對人體樣本中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶進行檢測，臨床上主要用于遺傳性紅細胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥的輔助診斷，產(chǎn)品臨床風險較高。企業(yè)在產(chǎn)品研發(fā)過程中對產(chǎn)品的認識程度不一，在參考品設置、分析性能評估等方面存在較多問題，有必要對這些共性問題進行總結規(guī)范，為申報企業(yè)從產(chǎn)品研發(fā)、生產(chǎn)至注冊申報階段提供更為全面的指導，為技術審評提供參考依據(jù)。

參考文獻：

[1]WHO.Invitrodiagnosticm