雙小泛素樣蛋白的化學(xué)合成、結(jié)構(gòu)解析及其與結(jié)合蛋白的交聯(lián)分析的任務(wù)書

雙小泛素樣蛋白的化學(xué)合成、結(jié)構(gòu)解析及其與結(jié)合蛋白的交聯(lián)分析的任務(wù)書任務(wù)書一、任務(wù)背景和意義泛素（Ub）和其修飾在細(xì)胞生物學(xué)中扮演著重要角色，如蛋白質(zhì)的降解、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA損傷修復(fù)、染色質(zhì)調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控等等。近年來，越來越多的研究表明，雙小泛素樣蛋白（diubiquitin，diUb）的結(jié)構(gòu)和功能也非常重要，關(guān)鍵的一步便是通過合成的技術(shù)來獲得理想結(jié)構(gòu)、功效和規(guī)模的diUb。二、任務(wù)目標(biāo)本任務(wù)主要目標(biāo)是：1.合成diUb化合物；2.使用高分辨率質(zhì)譜技術(shù)和核磁共振技術(shù)，對雙小泛素樣蛋白的結(jié)構(gòu)進行解析；3.通過對diUb和結(jié)合蛋白的交聯(lián)分析，在不同條件下分析兩者結(jié)合情況。三、任務(wù)內(nèi)容及階段目標(biāo)1.合成diUb化合物（1）合成diUb分子的單元：從泛素表達體系中純化得到的泛素物質(zhì)，經(jīng)由酶、纈氨酸和酯化反應(yīng)，可以在C端加入一分子羧基安全（BSA）;而N-端則加入對羥基苯甲酸酯（FMOC），形成N-FMOC-UB-BSA結(jié)構(gòu)。（2）合成diUb分子：通過核苷酸磷酸二酯縮合反應(yīng)，將兩份UB-BSA化合物連接起來，從而形成diUb化合物。2.對雙小泛素樣蛋白進行結(jié)構(gòu)解析（1）使用質(zhì)譜技術(shù)檢測diUb化合物的純度（2）使用核磁共振技術(shù)確定diUb化合物的結(jié)構(gòu)3.對diUb和結(jié)合蛋白的交聯(lián)分析（1）進行diUb和結(jié)合蛋白的結(jié)合反應(yīng)（2）在不同條件下，如pH、溫度、濃度、結(jié)合劑用量等，進行diUb和結(jié)合蛋白的結(jié)合反應(yīng)，并通過交聯(lián)試劑將二者交聯(lián)，從而解析二者結(jié)合情況。四、實驗條件和必要設(shè)備本任務(wù)所需實驗條件和必要設(shè)備包括但不限于：（1）分子生物學(xué)實驗室和設(shè)備，并具備常規(guī)蛋白表達、純化和鑒定的能力；（2）高分辨率液質(zhì)聯(lián)用分析儀；（3）高分辨率核磁共振儀；（4）交聯(lián)試劑、凝膠電泳儀、Westernblot儀等常規(guī)實驗室設(shè)備。五、預(yù)期成果通過本次任務(wù)，預(yù)期可以完成diUb化合物的合成、結(jié)構(gòu)解析和與結(jié)合蛋白的交聯(lián)分析，進一步揭示雙小泛素樣蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，為之后針對泛素家族的藥物研究提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。六、實驗流程實驗流程如下圖所示：七、安全注意事項1.實驗室使用前，必須熟知實驗室安全操作規(guī)程和應(yīng)急預(yù)案。2.操作前需佩戴良好的實驗服和手套，操作過程中注意反應(yīng)溶液的溫