熒光-光譜完整版本

熒光光譜熒光簡介常用熒光光譜及特征熒光強(qiáng)度影響因素?zé)晒夤庾V的光譜參數(shù)用途熒光：某些物質(zhì)受到照射后發(fā)出能量較低的光，一旦光照停止，光線也立即消失，稱為熒光。入射光和發(fā)射光頻率之差稱為斯托克頻移。滿足上述條件即為熒光。因此熒光范圍比較寬，從X射線到紅外光譜區(qū)仍然是熒光。其他的能量如（化學(xué)反應(yīng)、加熱、生物代謝等）也會(huì)有熒光。生活中很多現(xiàn)象都與熒光相關(guān)。如：鈔票防偽，日光燈管，螢火蟲發(fā)光。1.熒光介紹1）熒光產(chǎn)生及其物理機(jī)制S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫a)光吸收：熒光物質(zhì)從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，過程約10-15s。此時(shí)，熒光分子處于激發(fā)態(tài)。b)內(nèi)轉(zhuǎn)換：處于電子激發(fā)態(tài)的分子由于內(nèi)部的作用，以無輻射躍遷過渡到低的能級。c)外轉(zhuǎn)換：處于電子激發(fā)態(tài)的分子由于和溶劑以及其他分子的作用，以及能量轉(zhuǎn)移，過渡到低的能級d)熒光發(fā)射：如果不以內(nèi)轉(zhuǎn)換的方式回到基態(tài)，處于第一電子激發(fā)態(tài)最低振動(dòng)能級的分子將以輻射的方式回到基態(tài)，平均壽命約為10ns左右。e)系間轉(zhuǎn)換：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級間的非輻射躍遷。如電子自旋改變，禁阻躍遷，通過自旋—軌道耦合進(jìn)行。f）振動(dòng)馳豫：高振動(dòng)能級至低相鄰振動(dòng)能級間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間10-12s。2.常用熒光光譜1）熒光的激發(fā)光譜，發(fā)射譜激發(fā)譜：固定測量波長(選最大發(fā)射波長),化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度與激發(fā)光波長的關(guān)系曲線。熒光光譜有瞬態(tài)熒光光譜和穩(wěn)態(tài)熒光光譜兩類。通常熒光光譜指的是穩(wěn)態(tài)熒光光譜。熒光的發(fā)射譜：固定激發(fā)波長，發(fā)射強(qiáng)度與發(fā)射波長的關(guān)系。

熒光光譜特點(diǎn)靈敏度高：比紫外-可見分光光度法靈敏度高2-3個(gè)數(shù)量級，比原子吸收分光光度法高103～104倍，檢測限可達(dá)ng／mL線性范圍寬:0.005mg/L-50mg/L分析成本低設(shè)備簡單，操作簡單快速，計(jì)算機(jī)進(jìn)行儀器控制和數(shù)據(jù)處理提供激發(fā)光譜、發(fā)射光譜等許多信息2).熒光光譜的特征a.Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，振動(dòng)弛豫消耗了能量。

b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖

2,

1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光(如

‘2)。

c.

鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關(guān)系。3.熒光光譜儀及使用技術(shù)光源

激發(fā)單色器樣品池檢測器發(fā)射單色器檢測器

熒光是散射譜，所以一般在垂直入射方向接收。背景是沒有入射光，是“暗背景”，因此靈敏度更高。1）熒光光譜儀9光譜測試開機(jī)

電源——燈源2.發(fā)射譜

根據(jù)吸收譜中感興趣的峰確定激發(fā)波長，選擇合適的發(fā)射譜波長范圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等進(jìn)行發(fā)射譜的掃描。3.激發(fā)譜

根據(jù)發(fā)射譜中感興趣的峰確定發(fā)射波長，選擇合適的激發(fā)譜波長范圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等進(jìn)行激發(fā)譜的掃描。104.發(fā)射譜

根據(jù)激發(fā)譜中感興趣的峰確定激發(fā)波長，選擇合適的發(fā)射譜波長范圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等進(jìn)行發(fā)射譜的掃描。5.重復(fù)3、4步循環(huán)掃描得到理想的光譜圖。7.關(guān)機(jī)

光源——電源6.保存數(shù)據(jù)11光譜數(shù)據(jù)處理測得的數(shù)據(jù)結(jié)果需要應(yīng)用origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖分析。為了消除儀器本身的影響，測得的光譜曲線需要應(yīng)用校正曲線進(jìn)行校正。校正過的光譜數(shù)據(jù)可以應(yīng)用色坐標(biāo)軟件進(jìn)行顏色分析。

熒光隨著濃度增高，強(qiáng)度反而減小，稱為濃度猝滅。原因可能是：a濃度增加，分子碰撞機(jī)會(huì)增加，增加了非輻射損耗。b溶液中其他雜質(zhì)吸收發(fā)出的熒光。（內(nèi)濾光）c吸收譜和發(fā)射譜重疊，熒光又被吸收。（自吸收）d儀器原因3）.熒光光譜的環(huán)境效應(yīng)5.熒光實(shí)驗(yàn)方法及其用途熒光猝滅熒光偏振熒光能量共振轉(zhuǎn)移時(shí)間分辨熒光光譜熒光標(biāo)記

熒光猝滅泛指任何可以減低樣品熒光強(qiáng)度的過程。狹義主要指那些由于熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用所引起的熒光強(qiáng)度降低的情況。原因：溶劑猝滅劑和熒光物質(zhì)之間發(fā)生相互作用而引起熒光效率降低或激發(fā)態(tài)壽命縮短，導(dǎo)致強(qiáng)度降低。

1）.熒光猝滅

（1）熒光偏振現(xiàn)象及用途一旦用偏振光照射，從許多樣品出射的光也是偏振的。當(dāng)樣品各個(gè)方向出射的偏振光是不相同的，可以說樣品顯示出偏振的特性。研究偏振可以提供分子及周圍環(huán)境更多的信息：

偏振光照射到熒光分子上，分子對光的吸收和發(fā)射過程與分子框架相對偏振光的偏振方向相關(guān)。熒光偏振可以用來測量蛋白質(zhì)的變形，蛋白質(zhì)的結(jié)合以及蛋白質(zhì)的內(nèi)部動(dòng)力學(xué)。2）熒光偏振3）.熒光能量共振轉(zhuǎn)移4).時(shí)間分辨光譜：輸入脈沖，然后進(jìn)行對接收的信號進(jìn)行相應(yīng)分析。時(shí)間分辨壽命；時(shí)間分辨各向異性。

熒光各向異性可以采用穩(wěn)態(tài)測量，也可以用瞬態(tài)方法進(jìn)行測量。穩(wěn)態(tài)測量是得到的是一個(gè)平均值，雖然容易解釋，但需要做很多假設(shè)。瞬態(tài)測量是測量脈沖激發(fā)后的時(shí)間相關(guān)各向異性。可以直接從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中觀察得到并進(jìn)行解釋。各向異性與樣品尺寸、形狀以及標(biāo)記分子的柔性相關(guān)，需要從各種分子模型進(jìn)行計(jì)算擬合。各向異性衰減可以從TD或FD方法得到。目前還是采用時(shí)間分辨進(jìn)行測量。熒光壽命當(dāng)某種物質(zhì)被一束激光激發(fā)后,該物質(zhì)的分子吸收能量后從基態(tài)躍遷到某一激發(fā)態(tài)上,再以輻射躍遷的形式發(fā)出熒光回到基態(tài).當(dāng)激發(fā)停止后,分子的熒光強(qiáng)度降到激發(fā)時(shí)最大強(qiáng)度的1/e所需的時(shí)間稱