氨溴索在百草枯中毒大鼠肺纖維化中的保護(hù)作用

氨溴索在百草枯中毒大鼠肺纖維化中的保護(hù)作用[摘要]目的研究鹽酸氨溴索注射液（氨溴索）對(duì)百草枯（PQ）中毒肺纖維化的影響及相關(guān)機(jī)制。方法將105只SD大鼠隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組（NC組）、百草枯中毒組（PQ組）、氨溴索普通劑量治療組（PN組）、氨溴索大劑量治療組（PL組）、氨溴索超大劑量治療組（PE組），采取腹腔注射法構(gòu)建動(dòng)物模型：NC組注射1.25mg/kg生理鹽水；PQ組注射25mg/kg2%PQ溶液；PN組注射25mg/kg2%PQ溶液+30mg/（kg?d）氨溴索；PL組注射25mg/kg2%PQ溶液+50mg/（kg?d）及PE組注射25mg/kg2%PQ溶液+90mg/（kg?d）。在模型建立后21d處死動(dòng)物，肺組織行HE和Masson染色分別觀察炎癥以及纖維化情況；ELISA法測(cè)定支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白介素-6（IL-6）含量，q-PCR和Westernblot分別測(cè)定肺組織中組織金屬蛋白酶抑制因子1（TIMP-1）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果NC組肺組織正常，百草枯模型組大鼠肺損傷和肺組織膠原沉積明顯。各劑量氨溴索治療均能顯著減少百草枯中毒誘導(dǎo)的大鼠肺組織膠原沉積，同時(shí)伴有IL-6、TIMP-1和TNF-α表達(dá)的顯著下降（P[關(guān)鍵詞]氨溴索；百草枯；肺纖維化；白介素-6；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子1；腫瘤壞死因子α[中圖分類號(hào)]R595.4[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1673-7210（2017）04（a）-0035-04[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheeffectofambroxolonparaquat-inducedpulmonaryfibrosisinrats.Methods105SDratswererandomlydividedintofivegroups，NCgrouptreatedwith1.25mg/kgnormalsaline，PQgrouptreatedwith25mg/kg2%paraquat，PNgrouptreatedwith25mg/kg2%paraquat+30mg/（kg?d）ambroxol，PLgrouptreatedwith25mg/kg2%paraquat+50mg/（kg?d）ambroxol，PEgrouptreatedwith25mg/kg2%paraquat+90mg/（kg?d）ambroxol.Theratswerekiiledon21daftermodeling，thedegreesofacutepulmonaryinjuryandfibrosisweredetectedbyHEstainingandMassonstaining；themRNAandproteinexpressionsofTIMP-1andTNF-αwereevaluatedbyreal-timeqPCRandWestern-blotrespectively.ResultsThelungtissuewasnormalinNCgroup，whileitshowedthatsignificantinjuryoflungs，fibrosisandlargecollagendepositioninPQgroup.Afterambroxoltreatment，fibrosisandlargecollagendepositionreduced，expressionofIL-6，TIMP1-andTNF-αincreased（P1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑、藥品及儀器105只6周齡、體重250～310g的SPF級(jí)SD雄性大鼠購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)：SCXK（浙）2010-0044]。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬黃巖醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。按常規(guī)飼養(yǎng)條件，在氨溴索干預(yù)后第21天，予腹腔注射2%利多卡因2mL處死大鼠。主要試劑及藥品：氨溴索（批號(hào)：20090043），德國(guó)柏林格殷格翰醫(yī)藥公司；脂質(zhì)體、熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒，美國(guó)Promega公司；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑，Invitrogen公司；TaqManmiRNA檢測(cè)試劑盒，美國(guó)ABI公司；TIMP-1抗體（批號(hào)ESAP10803）TNF-α抗體（批號(hào)110520），美國(guó)NovusBiologicals公司；實(shí)時(shí)熒光定量9700PCR分析儀，美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。1.2動(dòng)物分組及百草枯中毒模型建立根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分組原則，105只大鼠隨機(jī)分為5組，即：正常對(duì)照組（NC組）5只，百草枯中毒?M（PQ組）、氨溴索普通劑量治療組（PN組）、氨溴索大劑量治療組（PL組）以及氨溴索超大劑量治療組（PE組）各25只。NC組按1.25mg/kg一次性腹腔注射生理鹽水；PQ組：按25mg/kg一次性腹腔注入2%PQ液，建立大鼠PQ中毒模型；氨溴索治療組：在PQ中毒模型成功后分別給予腹腔注射氨溴索，劑量分成30mg/（kg?d）、50mg/（kg?d）以及90mg/（kg?d）。本研究根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果及既往研究結(jié)果[8]，30mg/（kg?d）組染毒后21d大鼠行為、體重的變化及肺組織纖維化的病理改變，均符合百草枯中毒的特征，且在觀察期內(nèi)未出現(xiàn)死亡，故以30mg/（kg?d）的劑量作為建立模型的合適劑量。以出現(xiàn)飲食明顯減少，靜伏少動(dòng)，逐漸出現(xiàn)目光呆滯，反應(yīng)遲鈍，尿量減少，甚至明顯呼吸急促等典型的百草枯中毒的特征作為建模成功的標(biāo)準(zhǔn)。1.3BALF以及肺組織的收集處死大鼠后完整取出肺臟，氣管分叉處結(jié)扎右主支氣管，取出右肺組織，保存在-80℃冰箱以備用mRNA和蛋白測(cè)定；左肺給予冰生理鹽水灌洗（2.5mL×3次），回收BALF，進(jìn)行低溫離心（2500r/min，離心3～5min），取上清液，保存在-80℃度冰箱以備用；后左肺以10%中性甲醛溶液固定。1.4ELISA法檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IL-6的濃度取出上述BALF標(biāo)本上清，ELISA法檢測(cè)BALF中IL-6的濃度，操作具體按試劑盒說明進(jìn)行。1.5HE染色半定量評(píng)價(jià)肺損傷程度及Masson染色評(píng)價(jià)肺纖維化程度甲醛溶液固定的左肺組織，分別進(jìn)行HE染色及Masson染色。采用Mikawa評(píng)分[7]方法：①肺泡充血；②出血；③間隙或血管壁中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)或聚集；④肺泡間隔增厚或透明膜形成。按病變輕重，分為0～4分（0分為無或極輕微損傷；1分為輕度損傷；2分為中度損傷；3分為重度損傷；4分為極重度損傷），總分作為病理評(píng)分。Fulmer評(píng)分[8]來半定量肺纖維化：0級(jí)，無纖維化，得0分；Ⅰ級(jí)：輕度纖維化，受累面積40%，得4分；每組切片觀察4個(gè)高倍鏡，最后取平均值為肺纖維化得分。1.6qRT-PCR法檢測(cè)肺組織TNF-α和TIMP-1的mRNA表達(dá)運(yùn)用qRT-PCR法檢測(cè)右肺組織中TNF-α和TIMP-1的mRNA表達(dá)，具體按試劑盒說明進(jìn)行。TNF-α和TIMP-1表達(dá)的相對(duì)值=2-△△Ct。TNF-α引物：（F）5'-GTAGCCCACGTCGTAGCAAAC-3'和（R）5'-TGT？鄄GGGTGAGGAGCACATAG-TC-3'；TIMP-1引物：（F）5'-ATCGCTCTGGTAGCCCTTCT-3'和（R）5'-TCCCA？鄄GA-AATCATCGAGAC-3'。以U6為內(nèi)參，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.7Westernblot檢測(cè)組織TNF-α和TIMP-1蛋白的表達(dá)采用Westernblot檢測(cè)右肺組織中TNF-α和TIMP-1蛋白的表達(dá)情況，具體按試劑盒說明進(jìn)行。以目的蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度值比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P2.3各組大鼠TNF-α、TIMP-1mRNA與蛋白的表達(dá)Westernblot結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)組TNF-α和TIMP-1的mRNA與蛋白表達(dá)均顯著升高（P0.05）。見表3。3討論百草枯中毒大鼠肺的病理改變包括早期急性肺炎和后期肺纖維化，炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎性因子的釋放是其重要的病理特征，IL-6、TNF-α和TIMP-1等細(xì)胞因子在肺纖維化的發(fā)病及病理過程中的作用已引起廣泛的重視[4，9]。筆者發(fā)現(xiàn)，在百草枯中毒后第21天后，大鼠肺組織不僅存在肺損傷，同時(shí)伴有肺組織大量膠原沉積，并伴有TIMP-1、TNF-α和IL-6表達(dá)的增加，這與Nakamura等[10]的研究是一致的，說明百草枯中毒后期出現(xiàn)廣泛的肺纖維化。鹽酸氨溴索具有抗炎、抗氧化和促進(jìn)肺泡表面活性物質(zhì)釋放等作用，能夠減輕放射性、內(nèi)毒素等所致的急性肺損傷[11-12]。本研究主要發(fā)現(xiàn)，氨溴索能夠減輕百草枯中毒所導(dǎo)致的肺損傷和肺膠原的沉積，同時(shí)降低TIMP-1、TNF-α和IL-6的水平，提示氨溴索對(duì)于百草枯中毒所致的急性肺損傷及后期的纖維化有一定的保護(hù)作用。TNF-α與肺纖維化和肺間質(zhì)炎癥密切相關(guān)，在肺纖維化中起重要作用[13-14]。IL-6具有廣泛的生物學(xué)功能，在肺纖維化過程中，大量增生的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的IL-6，導(dǎo)致IL-6水平的升高[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)氨溴索能夠降低TNF-α和IL-6的表達(dá)，提示氨溴素對(duì)百草枯中毒所致的后期肺纖維化的保護(hù)作用可能與這兩個(gè)細(xì)胞因子相關(guān)。急性百草枯中毒患者由肺損傷漸進(jìn)發(fā)展為肺間質(zhì)纖維化，其發(fā)生發(fā)展與TIMP-1的表達(dá)相關(guān)，研究結(jié)果顯示百草枯中毒后導(dǎo)致TIMP-1水平升高，考慮為中毒后肺泡內(nèi)皮、上皮細(xì)胞受損，釋放一系列細(xì)胞因子和炎性遞質(zhì)，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶合成與活化，從而參與細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解，導(dǎo)致急性肺損傷[18-20]。而中毒后期，TIMP-1仍持續(xù)高于正常，此時(shí)，TIMP-1的表達(dá)占優(yōu)勢(shì)，參與肺纖維化的進(jìn)展[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)肺纖維化程度越高，TIMP-1的表達(dá)越高，而氨溴索干預(yù)后可以明顯降低TIMP-1的表達(dá)。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)氨溴索能夠減緩急性百草枯中毒引起的肺損傷及肺組織纖維化，這種作用與TIMP-1、TNF-α以及IL-6相關(guān)。因而，氨溴索對(duì)急性百草枯中毒引起的肺損傷及肺纖維化有一定的保護(hù)作用，值得進(jìn)一步研究。[參考文獻(xiàn)][1]KervégantM，MerigotL，GlaizalM，etal.ParaquatpoisoningsinFranceduringtheEuropeanban：experienceofthePoisonControlCenterinMarseille[J].JMedToxicol，2013，9（2）：144-147.[2]?麗，錢潔，葉延，等.百草枯反復(fù)小劑量腹腔給藥誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2011，20（12）：1285-1289.[3]梁笛.化痰藥物氨溴索的非化痰作用研究進(jìn)展[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2011，11，389（6）：554.[4]田同德，楊峰，唐靜雯，等.清熱活血散結(jié)復(fù)方對(duì)放射性肺炎及肺纖維化血清細(xì)胞因子IL-6，TNF-α，TGF-β1水平的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，5（4）：127-130.[5]章巍，劉新民，李海潮，等.博來霉素致大鼠肺纖維化模型肺組織MMP-2、MMP-9、MT1-MMP及TIMP-1、TIMP-2的表達(dá)[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2002，34（6）：716-721.[6]萬勇，張念，李劍平，等.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與Th17細(xì)胞的失衡及其對(duì)大鼠肺纖維化的影響[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2013，42（2）：161-166.[7]馬玉騰.大劑量氨溴索治療百草枯中毒所致急性肺損傷的實(shí)驗(yàn)研究[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2004.[8]FulmerJD，BienkowskiRS，CowanMJ，etal.Collagenconc？鄄entrationandratesofsynthesisinidiopathicpulmonaryfibrosis[J].AmRevRespirDis.1980，Aug，122（2）：289-301.[9]HillRP，ZaidiA，MahmoodJ，eta1.Investigationsintotheroleofinflammationinnormaltissueresponsetoirradiation[J].RadiotherOncol，2011，101（1）：73-79.[10]NakamuraT，UshiamaC.ChangesinconcentmtionsoftypeⅣcoUagenandtissueinhmitorofmetalloproteinase-1inpatientswithpanquatpoisoning[J].ApplToxicol，200l，21（6）：445-447.[11]蔡洪流，朱紅，李立斌.大劑量鹽酸氨溴索對(duì)大鼠內(nèi)毒素性肺損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)急救醫(yī)學(xué)，2006，26（8）：605-606.[12]李曉平，張衛(wèi)東，姜濤，等.大劑量鹽酸氨溴索對(duì)大鼠肺損傷后TLR-4/nF-κB的作用研究[J].中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2016，35（6）：647-650.[13]熊紅，江漢華，楊開云.銀杏葉提取物對(duì)肺纖維化模型大鼠血清中TNF-α、IL-6表達(dá)的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23（8）：2063-2064.[14]謝宗賢，徐兵，王繁麟，等.百草枯大鼠肺組織炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)和水楊酸鈉的干預(yù)作用[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2015，2