DB35T 1852-2019 豬繁殖與呼吸綜合征病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法

DB35Detectionmethodsofreal-timeRT-PCRforPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevi福建省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布*I 1 1 1 1 2 4 5 6瑞德利校準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)有限公司、東莞市中鼎檢測(cè)技術(shù)有限本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：鄭騰、張?bào)w銀、朱海、楊榮淇、付輝、張險(xiǎn)朋、柯麗群、張志燈、林杰、1豬繁殖與呼吸綜合征病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬繁殖與呼吸綜合征病毒實(shí)時(shí)熒光RT-P本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒的流行病病學(xué)調(diào)查、監(jiān)測(cè)凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格Ct值：循環(huán)閾值（CycleThreDEPC：焦碳酸二乙酯（DiethyPyrocarbonaPRRS：豬繁殖與呼吸綜合征（PorcineReproductiveandRespiratorySyndroPRRSV：豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratRNA：核糖核酸（RibonucleicRT-PCR：反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ReverseTranscriptionPolymeraseChainReacti4疾病概述4.1病原是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒粒子呈球型，直徑為554.2流行病學(xué)是PRRSV流行病學(xué)的重要特征。PRRSV可在感染豬體內(nèi)存在很長(zhǎng)時(shí)間。豬在感染病毒后2～14周均可通過(guò)2后感染PRRSV的新生仔豬，呼吸困難、急促，同時(shí)出現(xiàn)眼周及眼瞼水腫，結(jié)膜炎，藍(lán)耳，食欲不振，發(fā)熱，皮膚紅斑，腹瀉，震顫，毛發(fā)粗亂，厭食和神經(jīng)癥狀。斷乳仔豬感染PRRSV的典型臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、肺炎、昏睡及精神萎靡，如果伴發(fā)細(xì)菌感染，則死亡率顯5.1設(shè)備、材料和試劑5.1.1設(shè)備5.1.1.3冰箱（2℃~8℃和-20℃)。5.1.2材料和試劑5.1.2.3Trizol。5.1.2.5異丙醇。5.1.2.72×TaqPCRMasterMix。a)PRRSV-F5’-CACTACGGTCAACGGCACATT-3’；b)PRRSV-R5’-GCATATTTGACAAGGTTTACCACTCC-3’；c)PRRSV-PFAM-CTTTTCTGCCACCCAACACG擴(kuò)增片段約99bp，用水溶解至10μmol/L后，保存于-5.1.2.9質(zhì)控物質(zhì)：陽(yáng)性對(duì)照為含PRRSV基因目的片段5.2樣品的采集、處理、存放和運(yùn)輸5.2.1樣品采集和前處理過(guò)程的注意事項(xiàng)35.2.2.1棉拭子樣品鼻腔拭子和肛門(mén)拭子一起放入盛有1.0mL拭子懸液（符合附錄A中A.1的規(guī)定）的無(wú)菌Eppendorf管中，5.2.2.2組織樣品采集有明顯病變的淋巴結(jié)、扁桃體、肺、脾、腎、胸腺等組織樣品，無(wú)菌取0.5g0.3mL～0.5mL的組織懸液（符合附錄A中A.2的規(guī)定）進(jìn)行勻漿混勻，轉(zhuǎn)入無(wú)菌Eppendorf管中，5.2.2.3血清樣品在實(shí)驗(yàn)室操作過(guò)程中首先應(yīng)嚴(yán)格遵守GB19489的要求。分別取200μL待檢樣品，加入1mLTri試劑，用移液器充分吹打10～20次，室溫放置5min；加入200μL三氯甲烷，旋渦振蕩30放置15min；4℃下12000r/min離心15min；取上層水相加入等體積異丙醇，上下顛倒數(shù)次混勻，離心10min，棄上清液，沉淀室溫干燥5min；加20μLDEPC水溶解RNA沉淀。-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，RNA溶液應(yīng)避免反復(fù)凍融，并盡快用于檢測(cè)?？瞻讓?duì)照RNA提取也可采用等效的商品化RNA提在0.2mLPCR反應(yīng)管中分別加入如下試劑：2×TaqPCRMasterMix12.5μL；10μmol/L的正向?qū)CR反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀，擴(kuò)增反應(yīng)條件設(shè)定：50℃逆轉(zhuǎn)錄15min；94℃預(yù)變性3min；過(guò)正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線(xiàn)的最高點(diǎn)為準(zhǔn)，具體根據(jù)儀器噪音情陽(yáng)性對(duì)照樣品有對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線(xiàn)，而且Ct值≤30；陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增曲線(xiàn)，而且Ct值＞40檢驗(yàn)樣本Ct值≤35時(shí)，報(bào)告為豬繁殖與呼吸綜合征病豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽(yáng)性，否則報(bào)告為豬繁殖與呼吸綜合征病樣本Ct值為零或Ct值＞40時(shí)，報(bào)告未檢出豬繁殖與呼吸綜合征病45.4.4測(cè)序5試劑的配制A.1拭子懸液和制霉菌素（5000IU/mL調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4。A.2組織懸液制霉菌素（1000IU/mL調(diào)節(jié)pH至7.2～7.6