第三章 細胞生物學研究方法課件

第三章細胞生物學研究方法

細胞形態(tài)結(jié)構的觀察方法

細胞組分的分析方法

細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術第三章細胞生物學研究方法第一節(jié)細胞形態(tài)結(jié)構的觀察方法

光學顯微鏡技術（lightmicroscopy）

電子顯微鏡技術

(Electromicroscopy)

掃描探針顯微鏡（ScanningProbeMicroscope）

掃描遂道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope)

第三章細胞生物學研究方法一、光學顯微鏡技術（lightmicroscopy)

普通復式光學顯微鏡技術

熒光顯微鏡技術（FluorescenceMicroscopy）

激光共焦掃描顯微鏡技術（LaserConfocalMicroscopy）

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）

微分干涉顯微鏡（differentialinterferencecontrastmicroscope,DIC）

錄像增差顯微鏡技術（video-enhancemicroscopy）第三章細胞生物學研究方法顯微鏡和顯微鏡的分辨能力:肉眼：0.2mm;光鏡：0.2um;電鏡：0.2nm第三章細胞生物學研究方法普通復式光學顯微鏡技術

光鏡樣本制作分辨率是指區(qū)分開兩個質(zhì)點間的最小距離λ:

光源波長;α:物鏡鏡口角;N:介質(zhì)折射率第三章細胞生物學研究方法熒光顯微鏡技術（FluorescenceMicroscopy）

原理與應用

直接熒光標記技術

間接免疫熒光標記技術

在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位：

如綠色熒光蛋白(GFP)的應用

第三章細胞生物學研究方法激光共焦掃描顯微鏡技術

（LaserScanningConfocalMicroscopy）

原理

應用： 排除焦平面以外光的干擾，增強 圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重構樣品的三維結(jié)構。第三章細胞生物學研究方法

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）將光程差或相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，可用于觀察活細胞

微分干涉顯微鏡（differential-interferencemicroscope） 偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成 明暗區(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感。適于研究活細胞中較大的細胞器

錄像增差顯微鏡技術（video-enhancemicroscopy）計算機輔助的DIC顯微鏡可在高分辨率下研究活 細胞中的顆粒及細胞器的運動第三章細胞生物學研究方法雙目顯微鏡第三章細胞生物學研究方法正置顯微鏡倒置顯微鏡第三章細胞生物學研究方法熒光顯微鏡及其照片第三章細胞生物學研究方法共聚焦顯微鏡及其顯微圖像第三章細胞生物學研究方法激光共聚焦原理第三章細胞生物學研究方法暗視野成像原理第三章細胞生物學研究方法二、電子顯微鏡技術

電子顯微鏡的基本知識

電鏡與光鏡的比較

電鏡與光鏡光路圖比較

電子顯微鏡的基本構造

主要電鏡制樣技術

負染色技術

冰凍蝕刻技術

超薄切片技術

電鏡三維重構技術

電鏡種類掃描電子顯微鏡透射電子顯微鏡第三章細胞生物學研究方法電鏡與光鏡的比較

顯微鏡分辨本領光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差第三章細胞生物學研究方法電鏡與光鏡光路圖比較第三章細胞生物學研究方法電子顯微鏡的基本構造第三章細胞生物學研究方法主要電鏡制樣技術

超薄切片技術用于電鏡觀察的樣本制備示意圖

負染色技術（Negativestaining）與金屬投影 染色背景，襯托出樣品的精細結(jié)構

冰凍蝕刻技術（Freezeetching）（技術示意圖） 冰凍斷裂與蝕刻復型：主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構。 快速冷凍深度蝕刻技術（quickfreezedeepetching）

電鏡三維重構技術 電子顯微術、電子衍射與計算機圖象處理相結(jié)合而形成的具有重要應用前景的一門新技術。 電鏡三維重構技術與X-射線晶體衍射技術及核磁共振分析技術相結(jié)合，是當前結(jié)構生物學（StructuralBiology）

——主要研究生物大分子空間結(jié)構及其相互關系的主要實驗手段。

第三章細胞生物學研究方法透射電鏡及其圖像第三章細胞生物學研究方法掃描電鏡

原理與應用：

電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測器收集二次電子成象。

CO2臨界點干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題第三章細胞生物學研究方法掃描電鏡及其圖像第三章細胞生物學研究方法三、掃描遂道顯微鏡ScanningProbeMicroscope,SPM(80年代發(fā)展起來的檢測樣品微觀結(jié)構的儀器)

包括：STM、AFM、磁力顯微鏡、摩擦力顯微鏡等原理：掃描探針與樣品接觸或達到很近距離時，即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如量子力學中的隧道效應（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，并在計算機顯示出來，從而反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。第三章細胞生物學研究方法

裝置：掃描的壓電陶瓷，逼近裝置，電子學反饋控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集、處理、顯示系統(tǒng)。

特點：（1）可對晶體或非晶體成像，無需復雜計算，且分辨本領高。（側(cè)分辨率為0.1～0.2nm，縱分辨率可達0.01nm）； （2）可實時得到樣品表面三維圖象，可測量厚度信息；（3）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；非破壞性測量。 （4）可連續(xù)成像，進行動態(tài)觀察

用途：納米生物學研究領域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構。

第三章細胞生物學研究方法第二節(jié)細胞組分的分析方法

離心分離技術

細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法

特異蛋白抗原的定位與定性

細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

放射自顯影技術

定量細胞化學分析技術第三章細胞生物學研究方法一、離心分離技術

用途：于分離細胞器與生物大分子及其復合物

差速離心：分離密度不同的細胞組分

密度梯度離心：精細組分或生物大分子的分離第三章細胞生物學研究方法第三章細胞生物學研究方法差速離心:分離密度不同的細胞組分密度梯度離心:精細組分或生物大分子的分離第三章細胞生物學研究方法第三章細胞生物學研究方法二、細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、

酶、糖與脂類等的顯示方法

原理：利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些 特殊基團特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細胞中的分布和含量。

DNA：福爾根（Feulgen）反應－－紫紅色多糖類：PAS反應－－黃色脂肪：蘇丹III－－紅色蛋白質(zhì)：米倫（Millon）－－紅色第三章細胞生物學研究方法三、特異蛋白抗原的定位與定性

免疫熒光技術： 快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限

蛋白電泳(SDS)

與免疫印跡反應(Western-Blot)

第三章細胞生物學研究方法

免疫電鏡技術：

免疫鐵蛋白技術

免疫酶標技術

免疫膠體金技術

應用：通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等第三章細胞生物學研究方法四、細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

光鏡水平的原位雜交技術

（同位素標記或熒光素標記的探針）

電鏡水平的原位雜交技術

（生物素標記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標記結(jié)合）

PCR技術

第三章細胞生物學研究方法原位雜交技術第三章細胞生物學研究方法五、放射自顯影技術

原理及應用：

利用同位素的放射自顯影，對細胞內(nèi)生物大分子進行定性、定位與半定量研究；

實現(xiàn)對細胞內(nèi)生物大分子進行動態(tài)和追蹤研究。

步驟：

前體物摻入細胞（標記：持續(xù)標記和脈沖標記）

———放射自顯影第三章細胞生物學研究方法六．定量細胞化學分析技術

細胞顯微分光光度術（Microspectrophotometry）

利用細胞內(nèi)某些物質(zhì)對特異光譜的吸收，測定這些物質(zhì) （如核酸與蛋白質(zhì)等）在細胞內(nèi)的含量。 包括：

紫外光顯微分光光度測定法可見光顯微分光光度測定法第三章細胞生物學研究方法

流式細胞儀（FlowCytometry）

主要應用：用于定量測定細胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量； 測定細胞群體中不同時相細胞的數(shù)量； 從細胞群體中分離某些特異染色的細胞； 分離DNA含量不同的中期染色體。

第三章細胞生物學研究方法流式細胞術第三章細胞生物學研究方法第三節(jié)細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術

細胞的培養(yǎng)

細胞工程第三章細胞生物學研究方法一、細胞的培養(yǎng)一、細胞培養(yǎng)1，動物細胞:

類型：原代培養(yǎng)細胞（primaryculturecell） 繼代培養(yǎng)細胞（sub-culturecell）

細胞株（cellstrain）正常二倍體，接觸抑制

細胞系（cellline）亞二倍體，接觸抑制喪失2，植物細胞

（單倍體細胞培養(yǎng)，原生質(zhì)體培養(yǎng)，體細胞培養(yǎng)）

3，非細胞體系

（DNA復制，RNA轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)合成，高爾基體的膜泡運輸，細胞核裝配等）

細胞提取物，細胞核提取物第三章細胞生物學研究方法植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)細胞的克隆第三章細胞生物學研究方法

二、細胞工程

細胞融合（cellfusion）與細胞雜交（cellhybridization）技術

單克隆抗體（monocloneantibody）技術

細胞拆合與顯微操作技術

物理法結(jié)合顯微操作技術

化學法結(jié)合離心技術

制備核體（karyoplast）和胞質(zhì)體（cytoplast）。

其它技術

遺傳分析（mutant,knockout,knockin）

對細胞生命活動的研究成為當今生命科學發(fā)展