DB11∕T 2023-2022 魚類貝類環(huán)境DNA識別技術規(guī)范

DB11北京市市場監(jiān)督管理局發(fā)布 本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構和起草規(guī)則》魚類貝類環(huán)境DNA識別技術規(guī)范GB/T6682分析實驗室用水規(guī)從生物生活環(huán)境中直接提取到的不同物種DNA的總和，包含動植物脫落的細胞或游離的DNA，可一種用于擴增特定DNA片段的分子生物學技術，包括變性、退火、延般把堿基序列相似度不小于97%的OTU定義為為高通量測序時區(qū)分不同樣點來源的物種基因序列，在擴增引物5’端增加的序列特異性短片段標除非另有說明，試劑均使用符合國家標準的分析純試劑，試驗用水均使用——消毒液：次氯酸鈉和蒸餾水配制，有效氯濃度）；——75%乙醇：無水乙醇和超純水3:1配制，其中消毒用75%乙醇）；）；——蛋白酶K：酶活力單位為20；——乙酸銨（CH3COONH4——乙酸鈉（CH3COONa·3H2O）；——脫氧核糖核苷三磷酸：脫氧腺苷三磷酸、脫氧鳥嘌呤三磷酸、脫氧胸苷三磷酸、脫氧胞苷三磷酸的等摩爾數(shù)混合物（各2.5×10-3m），——低溫離心機：最高離心轉(zhuǎn)速不低于13000rpm，溫控范圍低至4℃;d)河流型水體：參照SL219中水質(zhì)監(jiān)測斷面6.2.2離岸樣點：魚類eDNA樣品在水深<10m處水面下0.5m采集，水深≥10m處分水面下0.5m7.1.3剪刀和鑷子用自來水和75%乙醇清洗，超純水浸洗，烘干備用。7.2.1連接真空泵和抽濾器，用鑷子取0.45μm孔徑的混合纖維素酯濾膜置于玻璃濾膜臺中央，蓋上浴裂解3h，期間每隔0.5h進行間斷性震蕩；c)將裂解液轉(zhuǎn)移到對應編號的新離心管中，加入等體積Tris飽e)轉(zhuǎn)移上清液到對應編號的新離心管中，j)使用超微量紫外分光光度計檢測總DNA濃度和質(zhì)量，利用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析DNA完也可采用符合5.1中要求的動物組織細胞DNA提取試劑盒完成，具體操作也可采用符合5.1中要求的柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒完成，具體操作下游引物R：CATAGTGGGGTATC上游引物F：GGWACWGGWTGAACWGTW可參考附錄A中列出的8堿基條形碼參考序列進行添加，也可根據(jù)情況自行設計添加。不影響擴增PCR擴增體系包括PCR聚合酶、聚合酶緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、上下游引物、經(jīng)8.1和8.2提對PCR擴增樣品進行第二代高通量測序，利用分析軟件對測序結(jié)果數(shù)據(jù)進行預處理，去除測b)去除讀長上的引物序列，去除錯配擴增序列，此步驟處理后一般僅留存35~45%的序列；d)去除測序深度較低的序列，即測序所得堿基總量小于10×的序列；e)去除由于測序讀長限制導致的末端序列不穩(wěn)定的部f)將前后兩端的讀長拼接成一條完整的序列，最低重疊堿基數(shù)一般設置為20bp；g)將拼接的序列進行去重復處理并排序，即刪除相同的序列，每個序列僅保留一條；i)將篩選和處理后的結(jié)果輸出fasta格式的序列文件保存。a)經(jīng)篩選與處理的測序數(shù)據(jù)需使用相關生物信息學分析軟件基于97%序列相似度進行聚類，獲相似度和覆蓋度均大于85%的OTUs；d)提取物種的分類信息，包括界、門、綱、目、科、屬、種等界門綱目科屬種1...b)樣品采集完成后置于4℃保存、運輸并確保在24h內(nèi)完成抽濾，濾膜在a)抽濾所用器具規(guī)范滅菌和清洗，避c)DNA提取和純化所用器具按規(guī)范滅菌，耗材一次性使用，避免交叉污染。d)確保純化后的PCR產(chǎn)物純度合格，按規(guī)定保存避免降解。123456789[1]HJ710.8-2014生物多樣性觀測技[3]DB43/T432-2[4]黃祥飛，陳偉民，蔡啟銘.《湖[5]孟偉，